中草药红茶菌体外抗甲I流感病毒(H1N1)作用研究

蒋小强,符乃方,符启俊,徐培平，张奉学，蒋盛军*，邱红辉，高李泽，何萍，谢峥嵘，陈吉雄

（1.海南东方市畜牧局动物疾病预防控制中心海南东方,570100；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所；3.广州中医药大学热带医学研究所）

中草药红茶菌体外抗甲I流感病毒(H1N1)作用研究

蒋小强1,符乃方2,符启俊2,徐培平3，张奉学3，蒋盛军2*，邱红辉1，高李泽1，何萍1，谢峥嵘1，陈吉雄1

（1.海南东方市畜牧局动物疾病预防控制中心海南东方,570100；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所；3.广州中医药大学热带医学研究所）

目的：从体外抗病毒试验观察中草药红茶菌制剂抗甲I型流感病毒（H1N1）作用。方法：利用细胞共培养法测定中草药红茶菌的细胞毒性；体外试验以H1N1感染MDCK细胞，观察用鸡红细胞凝集抑制法测试中草药红茶菌制剂体外对H1N1流感病毒的抑制效果。结果：中草药红茶菌制剂在1∶2稀释度时对MDCK细胞存在66.25%的毒性作用，其在MDCK细胞上的半数毒性浓度TC50约为2-5倍稀释度；中草药红茶菌制剂在半数毒性浓度1∶2和无毒浓度1∶3稀释度时对流感病毒FM1株具有完全抑制作用，而在1∶4稀释度下对病毒有50%的抑制作用，高于1∶4稀释度的受试样品则不能抑制流感病毒FM1株的对鸡红细胞的凝集作用。

中草药红茶菌；流感病毒；体外

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。

甲型流感病毒，又称A型流感病毒虽然感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。但是，近年来，由于不同类型的流感病毒发生基因重组而产生跨宿主的新型流感病毒，如能传染人的猪流感病毒和禽流感病毒[1]。

虽然流感病毒作为一种呼吸道病毒，传染性非常强，但是流感病毒却是一种抵抗力较弱的病毒。它对于乙酸、乳酸等酸性化学试剂尤其敏感。因此，根据流感病毒对酸的敏感性，研制出各种酸性消毒剂，通过喷雾消毒来预防流感。但是这些消毒作用都是瞬时性的。消毒过后，外面的流感病毒依然可以通过呼吸道和消化道侵染易感动物。红茶菌是一种包含醋酸菌、酵母菌为主、产酸能力很强的共生菌群，它能在醋酸菌、酵母菌的共生作用下产生醋酸、柠檬酸、葡萄糖酸等酸性物质，红茶菌培养液pH值一般保持在2.5-4.5之间[2]。红茶菌对人体胃肠道的保健机理之一就是依靠降低胃肠道的pH值来抑制病原菌的生长[3]。茶叶、罗汉果、甘草、野菊花是一些具有药食两用的中草药植物，这些植物的提取液普遍具有提高动物免疫力、拮抗病原细菌、病毒等方面的作用。因此，如果利用红茶菌发酵上述茶叶等提取液来制备微生态制剂，将这种中草药红茶菌喷入这些流感病毒易感动物的呼吸道和消化道，红茶菌中的复合菌群将通过产生醋酸等有机酸来降低这些流感病毒感染途径的pH值，同时在茶叶等中草药提取液的协同作用下将能有效预防流感的发生。本文报道了这种中草药红茶菌的制备、中草药红茶菌体外抗流感病毒活性的试验结果。

1 材料

1.1 中草药红茶菌制剂：本研究室制备；阳性药物：利巴韦林，购自广东肇庆鼎湖药业有限公司，纯度＞98%，批号：120327。

1.2 培养基：DMEM培养基（GIBCO公司）、小牛血清（广州畜牧场，批号：20111213）。

1.3 病毒：A/FM1/47(H1N1)，本实验室冻存保种，其TCID50=4.67。

1.4 细胞：狗肾细胞MDCK，P3，本实验室冻存保种。

2 实验方法

2.1 中草药红茶菌制剂的制备

所用红茶菌菌种购自北京食品研究所。红茶菌母液的制备参考吕爱军等提供的方法[7].制备中药提取液：将0.2%茶叶、0.5%甘草、0.2%罗汉果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，过滤后冷却到约30℃以下时加入20%红茶菌母液，静置发酵2周后用于检测或临床使用[2]。

2.1 中草药红茶菌制剂的处理

中草药红茶菌制剂样品以0.22μm微孔过滤除菌，以0.5ml/管分装备用；阳性药物利巴韦林，用DMEM培养基制备成母液浓度为10mg/ml，以0.22μm微孔过滤除菌，以0.5ml/管分装备用。

2.2 中草药红茶菌对MDCK细胞毒性的测定

常规消化MDCK细胞后，以1.0×105个/ml密度接种于96孔细胞板上，置于37℃培养。待细胞汇合至紧密单层后，弃上清，加入含不同浓度的培养基（小牛血清含量为5%）继续培养4天。每个实验浓度接种4个细胞复孔。4天后终止实验，每孔加入MTT 100μl（浓度为0.5%）避光孵育4小时后，弃上清。加入等量DMSO充分溶解后，于λ490下读取对应的OD数值。通过Read-Muench法计算受试样品的TC50。实验过程中设置不加药物的细胞对照孔。样品稀释比例：1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶16、1∶20、1∶32。

2.3 受试样品在MDCK细胞上对流感病毒FM1抑制作用的测定

常规消化细胞后，以1.0×105个/ml密度接种于96孔细胞板上，置于37℃培养。待细胞汇合至紧密单层后，弃上清，加入含不同浓度的培养基（小牛血清含量为5%）继续培养4天，每个实验浓度接种4个细胞复孔。其中两孔细胞攻击等量的100TCID50病毒悬液0.1ml，于35℃吸附1-2小时。吸附结束后丢弃病毒悬液，重新加入对应的含药培养基继续培养。4天终止实验，将每孔细胞上清液吸取50μl于血凝板上，再加入等量的0.5%鸡红细胞混悬液，室温下孵育30分钟，观察样品对流感病毒FM1凝集红细胞的抑制作用。实验过程中设置不加药物的细胞对照孔及阳性药物利巴韦林对照组、病毒对照组。样品稀释比例：1∶2、1∶3、1∶4、1∶5；阳性药物利巴韦林：2.0、0.5、0.125、0.031mg/ml.

3 结果

3.1 中草药红茶菌制剂的细胞毒性

在初步筛选中，受试样品木薯中草药微生态制剂在1∶2稀释度时对MDCK细胞存在66.25%的毒性作用。经过初步计算，其在MDCK细胞上的半数毒性浓度TC50约为2-5倍稀释度。

表1.受试样品在MDCK细胞上半数毒性浓度的测定（MTT法）

3.2 中草药红茶菌制剂对甲I流感病毒(H1N1)的抑制作用效果

用鸡红细胞凝集抑制法以及流感病毒标准株FM1测试了中草药红茶菌制剂体外对流感病毒的抑制效果，结果如表1所示：经过重复实验，受试样品中草药红茶菌制剂在半数毒性浓度1∶2和无毒浓度1∶3稀释度时对流感病毒FM1株具有完全抑制作用，而在1∶4稀释度下对病毒有50%的抑制作用，高于1∶4稀释度的受试样品则不能抑制流感病毒FM1株的血凝素，不能抑制流感病毒FM1株对鸡红细胞的凝集作用，这表明中草药红茶菌在体外对甲I型流感病毒具有较好的抑制作用。

表2.中草药红茶菌制剂对FM1流感病毒的体外抑制作用

*：在毒性结果中，“+”说明受试样品对细胞存在毒性作用；“—”说明受试样品对细胞无明显毒性作用。在血凝程度中，“#”说明鸡红血球发生75%的凝集，提示对流感病毒FM1株无明显抑制作用；“—”，说明鸡红血球不发生凝集，提示样品对流感病毒FM1株具有抑制作用，能抑制病毒对鸡红细胞的凝集作用。

4 讨论

我们以前对中草药红茶菌体外抗口蹄疫病毒的研究表明：中草药红茶菌在1∶4稀释后，对BHK21细胞无毒性反应，并可有效抑制1000 TCID50口蹄疫病毒在BHK21细胞生长繁殖；1∶2稀释的红茶菌微生态制剂对3日龄乳鼠无毒性反应，并可有效杀灭1000 LD50口蹄疫病毒[8];在此研究的基础上，取健康猪20头，喷雾和口服中草药红茶菌3d后，进行O型口蹄疫毒株(猪O型O/China/99株鼠毒)攻毒试验;攻毒后，继续对猪群进行喷雾和口服给药，观察中草药红茶菌对攻毒猪的保护作用及体内抗口蹄疫病毒的作用。攻毒结果显示，低剂量给药猪3/5保护，中剂量给药猪1/5保护，高剂量给药猪0/5保护;在低剂量给药条件下，攻毒保护效果优于中剂量和高剂量;从攻毒后的第1天到第7天，陆续从试验猪全血中检测到口蹄疫病毒，其中中草药红茶菌高浓度预防组猪的口蹄疫病毒的复制水平最高，中剂量组较低，低剂量组复制水平最低。给药合适剂量的中草药红茶菌对猪体内的口蹄疫病毒具有一定的抑制作用[4]。

根据口蹄疫病毒、流感病毒对酸敏感的特性以及高浓度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒、流感病毒的体外抑制和杀灭试验结果，我们推测中草药红茶菌中的有机酸对流感病毒的杀灭应起到主效作用，同时也与广谱性的抗病毒植物茶叶、甘草、罗汉果等的提取液有关；由于口服和喷雾中草药红茶菌制剂对体内口蹄疫病毒的繁殖也有抑制和杀灭作用，所以我们推测中草药红茶菌种的中草药提取液成分吸收进入动物体内起到杀灭和抑制病毒繁殖的作用，如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激细胞产生干扰素来提高动物机体的抗病毒特性[5,6]。

我们以前在猪上的口喷和鼻喷中草药红茶菌的试验结果表明：使用一次中草药红茶菌，在一周之内，从猪的粪便中分离出大量醋酸菌。这表明红茶菌中的醋酸菌和酵母复合共生菌群在猪的消化道中能存活能长达1周或更长的时间。如果对动物喷雾中草药红茶菌制剂，我们推测中草药红茶菌中的醋酸菌、酵母等益生菌在动物的呼吸道以及消化道存活较长时间，这些益生菌能够持续产生醋酸等有机酸来抑制和杀灭流感病毒，从而实现对流感相对较为长效的预防。由于这种有效预防时间仅为1—2周的时间，所以我们需要周期性（如每周一次）使用这种中草药红茶菌，才能实现对流感的长效预防。除了抗流感病毒、口蹄疫病毒的特性，中草药红茶菌具有一般微生态制剂的优良特性如无毒、环保、促进生长、提高动物的免役力等优良特性，因此这种多功能性将有助于促进这种中草药红茶菌在生产中的推广和应用。由于当前仅限于体外抗流感病毒的试验研究，进一步研究中草药红茶菌在动物体内的抗病毒效果将有助于进一步研究中草药红茶菌的抗病毒机理以及推广应用于流感病毒的预防。

∶

[1]Garten RJ，Garten R，Suggestion R，et al.Antigenic and genetic characteristics ofswine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulatingin humans[J].Science. 2009,325(5937)∶197-201.

[2]符乃方，吴俊才，符启俊,等.中草药红茶菌的制备及其体外抗口蹄疫病毒活性[J].安徽农业科学，2014.42 (17)∶5500-5502.

[3]Dufresne C,Farnworth E.Tea,Kombucha,and health∶a review[J].Food Res Inter,2000,33(6)∶409-421.

[4]符乃方，吴俊才，符启俊,等.中草药红茶菌的制备及其体内抗口蹄疫病毒活性[J].安徽农业科学2014，42 (18)∶5892-5894，5908.

[5]王彦芳,秦林,王焱,等.中药抗病毒研究进展[J].中医中药，2008,14（22）：3488-3490.

[6]苏俊喜，周颖，门文军，等.甘草有效成分应用的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2010,31(8)∶111-113.

S853.7

B

1003-8655（2017）01-0003-02

2016-11-15

本课题为国家现代农业产业技术体系项目资金资助(nycytx-17)以及中国热带农业科学院院所基本科研业务费项目（PZS009）资助。

蒋小强（1986-），男，汉族，甘肃张掖人，研究生学历，主要从事畜禽传染病的预防研究。

*通讯作者,蒋盛军，E-mail∶18708938111@139.com。