木薯环指蛋白基因MeRFP8克隆及表达

薛晶晶, 陈松笔

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 儋州 571737)

木薯环指蛋白基因MeRFP8克隆及表达

薛晶晶, 陈松笔

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海南 儋州 571737)

采用RT-PCR方法，首次从木薯华南8号(SC8)克隆一个环指蛋白RFP基因家族成员MeRFP8.该基因cDNA包含1 059 bp的开放阅读框，编码一个由352个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质分子质量为39.23 ku，理论等电点为4.84，C末端含有保守的结构域RING finger domain (Ring-H2 zinc finger)，属于C3H2C3型环指蛋白.利用实时荧光定量PCR分析MeRFP8基因在木薯SC8及其同源四倍体叶片的表达水平，结果显示：5 ℃低温胁迫24 h内，SC8和其四倍体MeRFP8基因先下调表达，后上调表达，呈“V”字型.而且MeRFP8基因在SC8的表达变化水平比其同源四倍体大.推测MeRFP8基因可能参与木薯的低温响应.

木薯; 环脂蛋白;MeRFP8; 基因克隆; 冷胁迫

环境胁迫如高温、低温、干旱以及盐胁迫等对植物生长，发育以及生物产量和品质特性产生很大影响[1,2].为响应环境胁迫，植物会促使某些生理机制和代谢通路发生改变，以适应新的环境变化[3,4].许多转录因子，如AP2/EREBP，bZIP，WARKY，MYB和一些锌指蛋白，已有报道在植物应对环境胁迫中起着重要作用[5].

锌指蛋白是真核生物中较丰富的一类蛋白质，在生物体生长发育的各个阶段起着重要作用，包括激活转录，调控细胞凋亡，蛋白质折叠和组装等[6].环指蛋白(ring finger protein, RFP)是一类特殊的锌指蛋白，一般包含40～60残基，结合2个锌原子[7]，含有1个C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C的“交叉”模型；可能参与介导蛋白-蛋白互作，存在2个变种，C3HC4型和C3H2C3 (RING-H2 finger) 型，具有不同的半胱氨酸/组氨酸模式[8].含有环指特征的基因RING1[9]在16年前首次在人类中发现，随后，大量含有环指特征的蛋白被报道[10]，迄今为止，环指的特定功能还不清楚.目前，许多含有环指结构的蛋白质主要参与转录调控和蛋白-蛋白互作等[7,11,12]，最新研究表明，大部分环指蛋白具有E3泛素连接酶活性，能特异地与E2泛素结合酶相互作用，从而促进泛素化[13]，通过泛素化降解蛋白质是植物在许多逆境信号途径中的重要环节.因此，推测环指蛋白主要对环境刺激的反应起重要作用.例如，它们参与光系统建成的负调控[14,15]，非生物胁迫等[16,17].研究发现拟南芥COP1基因编码一个抑制光形态建成和光调控发育分子的环指蛋白[18,19]；沙蒿AdZFP1编码环锌指锚蛋白基因，在干旱胁迫中起重要作用[20]；拟南芥HOS1基因属于C3HC4型环指蛋白，具有E3泛素连接酶活性，主要在低温信号转导中起作用[16].野生型番茄ShATL78L基因编码C3H2C3型环指蛋白，主要在低温胁迫下起作用，同时也对干旱、盐、热和渗透性应激等非生物胁迫起作用[21].马铃薯SbRFP1属于C4HC4型环指蛋白，能够在低温胁迫下对马铃薯块茎的糖分积累进行负调控[22].木薯MeRZF基因属于C3H2C3型环指蛋白，从木薯块根中获得，主要在干旱胁迫中起重要作用[23].

木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(ManihotP. Mill.)的多年生植物[24,25]，原产南美洲热带，是世界三大薯类作物之一.木薯贮藏根淀粉含量在27%～34%之间，被誉为“淀粉之王”，是世界热带地区继水稻、玉米、高粱之后的第四大粮食作物，为热带、亚热带近8亿人口提供了基本食粮，是我国重要的工业淀粉和生物质能源原料，也是我国潜在的粮食作物[26].低温是限制植物自然分布和栽培区域的主要因素，寒害使木薯北移扩大种植受到较大影响.因此，改良木薯品种，发掘耐寒基因，选育耐寒种质，扩大木薯北移种植面积成为木薯研究的重要方面.目前关于木薯环指蛋白基因(RFP)与低温胁迫相关的研究还未见报道.本研究从木薯叶片中克隆了环指蛋白基因MeRFP8，研究在低温胁迫下该基因在木薯SC8及其同源四倍体的表达水平，为开展木薯抗寒性分子标记辅助育种提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

木薯(ManihotesculentaCrantz)华南8号(SC8)及其同源四倍体组培苗，南植199(NZ199)及其同源四倍体组培苗.RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，Dnase Ⅰ，DNA凝胶回收试剂盒购自天根公司.反转录试剂盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Ferments公司.PrimeSTAR Max DNA Polymerase，实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus)购自大连宝生物公司.pEASY-Blunt Simple Cloning Kit购自北京全式金公司.其它生化试剂均为进口或国产分析纯试剂.引物合成和DNA测序由Invitrogen公司完成.

1.2 方法

1.2.1 材料处理 对生长约50 d的SC8及其同源四倍体组培苗进行5 ℃低温处理，在处理0、2、4、8和24 h后，一部分叶片用于酶活性测定；另一部分叶片经液氮速冻后，用于RNA提取.每个处理时间进行3次重复.

对生长约50 d的NZ199及其同源四倍体组培苗进行5 ℃低温处理，在处理0、4和8 h后，取叶片经液氮速冻后用于RNA提取.每个处理时间进行3次重复.

1.2.2 生理指标测定 植物丙二醛(MDA)测试盒，过氧化氢(H2O2)测试盒，过氧化氢酶(CAT)测试盒，过氧化物酶(POD)测试盒均购自南京建成生物工程研究所，测试方法按照说明书进行.

表1 引物序列Table 1 List of primer sequences

1.2.3 总RNA提取与cDNA合成 木薯叶片RNA的提取参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作说明进行，用DnaseⅠ柱上消化RNA样品中残留的微量DNA.cDNA第一链的合成参照Ferments公司试剂盒的说明书进行.

1.2.4MeRFP8基因全长cDNA扩增 从木薯低温胁迫处理后的MSAP分析中分离到一段包含Ring-finger domain结构域的序列，将该序列比对Phytozome11中Manihotesculentav6.1(Cassava)数据库，以比对获得的DNA序列设计引物(表1), 采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行序列的克隆.用1 μg叶片RNA，20 μL反应体系，逆转录合成第一链cDNA.全长cDNA的扩增体系含PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL、RFP8-F (10 μmol·L-1) 2.5 μL、RFP8-R (10 μmol·L-1) 2.5 μL、cDNA模板0.5 μL、灭菌水补足50 μL.扩增程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s、共30个循环；72 ℃延伸10 min.0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收纯化目的条带，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector载体上测序.利用BLAST检索GenBank数据库，进行同源性分析.

1.2.5 生物信息学分析 利用DNAMAN软件对MeRFP8全长cDNA序列进行比对分析，NCBI网站ORF Finder软件进行开放阅读框(ORF)预测，同时翻译成蛋白序列.ProtParam软件分析该蛋白的分子质量与等电点；NCBI在线软件CDD分析蛋白的保守结构域；TMHMM Server v. 2.0在线软件进行跨膜结构域分析；PSORT在线软件对该蛋白进行亚细胞定位预测；ProtScale在线软件预测该氨基酸序列的疏水性/亲水性；SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在线软件预测蛋白的二级结构.从NCBI数据库下载其它植物的RFP蛋白序列，首先用Clustal W进行序列多重比对，再利用MEGA 4.0软件，选择neighbour-joining(NJ)模型，并进行1 000次bootstrap统计学检验，构建包括MeRFP8蛋白序列在内的植物RFP蛋白的系统进化树.

1.2.6 实时荧光定量PCR分析 采用Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR系统，实验操作按仪器使用说明书进行.取1 μg RNA，逆转录合成第一链cDNA，稀释10倍后作为实时定量PCR分析的模板.20 μL反应体系中，包含1 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol·L-1QPCR-RFP8-F和QPCR-RFP8-R引物(表1)各0.6 μL、灭菌水补足20 μL.PCR反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s、共40个循环，循环完后进行产物溶解曲线分析.以MeActin作为内参基因(表1)，利用CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析，以2-△△Cq算法进行基因的相对定量表达.采用Duncan多重比较对对照和处理样品的相对定量结果进行统计分析.

*标示终止密码子.图1 MeRFP8核苷酸序列和推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and derived amino acid sequences of MeRFP8

1.2.7 分析方法及数据处理 采用GraphPad Prifm 5.0软件进行数据分析和作图，采用SPSS 18.0软件进行差异性等相关统计分析.

2 结果与分析

2.1MeRFP8基因全长cDNA克隆及蛋白质结构特性

通过RT-PCR扩增及测序，获得MeRFP8基因编码框序列1 059 bp，编码352个氨基酸(图1)，分子质量为39.23 ku，理论等电点为4.84，不稳定系数为55.50，属于不稳定类蛋白.通过NCBI在线软件CDD分析发现，该蛋白在C末端含有植物RFP基因共有的保守结构域RING finger domain (Ring-H2 zinc finger)，属于C3H2C3型环指蛋白.TMHMM Server v. 2.0在线软件预测显示，该蛋白无跨膜结构域；PSORT分析显示，MeRFP8定位于细胞核的可能性为65.2%；ProtScale预测表明，MeRFP8蛋白属于疏水性蛋白；SOPMA分析显示，MeRFP8蛋白二级结构由24.72% α-螺旋、21.31%延伸链、7.39% β-转角和46.59%无规则卷曲组成.

2.2MeRFP8推导的氨基酸序列比对及进化树构建

采用DNAMAN软件对MeRFP8推导的氨基酸序列与其它植物中的RFP蛋白序列进行比对(图2)，结果显示，MeRFP8蛋白序列与麻风树RING-H2 finger protein ATL52-like (Jatrophacurcas，XP_012070295.1)、杨树POPTR_0013s07100g (Populustrichocarpa，XP_002319229.2)、可可RING/U-box superfamily protein, putative (Theobromacacao，XP_007029812.1)、胡杨RING-H2 finger protein ATL52 (Populuseuphratica，XP_011011235.1)、甜橙hypothetical protein CISIN_1g036833mg (Citrussinensis，KDO46830.1)、金钱橘CICLE_v10031956mg (Citrusclementina，XP_006437376.1)、梅RING-H2 finger protein ATL52-like (Prunusmume，XP_008232120.1)蛋白相似性分别为60.15%、58.17%、55.20%、55.69%、53.71%、53.22%、47.52%.

下划线表示Ring-finger domain结构域；*表示特征序列中保守的氨基酸残基.图2 MeRFP8推导氨基酸序列与其它植物RFP蛋白序列比对Fig.2 Amino acid alignment of MeRFP8 with RFPs from other plant species

选取NCBI数据库中与MeRFP8蛋白较相似序列7条以及低温响应的RFP蛋白序列4条，利用软件MEGA 4.0构建系统进化树.聚类结果显示，木薯MeRFP8与麻疯树Jatrophacurcas，XP_012070295.1聚为一类，亲缘关系最近(图3).

2.3 低温胁迫对SC8及其同源四倍体生理指标的影响

5 ℃低温处理4 h后，SC8组培苗的叶片开始出现萎缩现象，而SC8四倍体的组培苗叶片直到24 h才出现局部萎缩.同时，低温胁迫会使植物体内产生大量活性氧，进而对植物细胞形成氧化胁迫伤害.CAT、POD是酶促防御系统中重要的保护酶，可以有效地清除膜脂过氧化物对植物造成的伤害.低温处理下，MDA含量的变化可以作为衡量植物抗寒性的重要生理指标.

5 ℃处理下，SC8及其四倍体组培苗的MDA含量均有所增加，但是SC8增加的幅度大于其四倍体，与抗寒能力越强，MDA含量增加越慢是一致的.CAT是对H2O2分解的活力单位，5 ℃处理达到24 h时，SC8中CAT的活力达到了最大值，而SC8四倍体在整个处理过程中CAT的变化没有显著差异.POD的活力在整个处理过程中呈现先下降后上升的趋势，而SC8四倍体的上升幅度大于SC8.结合5℃处理后的表型观察，推测SC8四倍体的耐寒性比SC8强.

图4 低温(5 ℃)胁迫下生理指标的变化趋势Fig.4 Variation tendency of physiological indexes under low-temperature treatments (5 ℃)

2.4MeRFP8基因表达分析

采用实时荧光定量PCR技术对MeRFP8基因在5 ℃低温胁迫下的基因表达水平进行分析.将SC8组培苗5 ℃低温处理24 h，结果表明，与0 h相比，MeRFP8基因在5 ℃低温处理2 h表达量开始下降，4 h时表达水平最低，表达量是对照的0.27倍；处理8h后表达量开始上升，处理24 h后基因表达上调至最高，但表达量依然低于对照，是对照的0.6倍.而SC8同源四倍体组培苗中MeRFP8基因表达在5 ℃低温处理4 h下调幅度达到最大，8 h后基因表达量逐渐上升，24 h时表达量与对照相同，且整个低温处理过程中表达量变化幅度较小，没有显著性差异.在5个处理时间点，SC8组培苗MeRFP8基因的表达变化比四倍体明显(图5).

NZ199及其四倍体组培苗5 ℃低温处理0 、4和8 h后，表达结果显示：MeRFP8在NZ199及其四倍体中的表达趋势与SC8一致(图5).结合SC8及其四倍体5 ℃低温胁迫下生理指标结果以及已报道的文献[27,28]，即四倍体比二倍体耐寒性强，推测MeRFP8基因可能参与木薯的低温响应.

图5 低温(5 ℃)胁迫下MeRFP8基因的表达Fig.5 MeRFP8 expression in response to low-temperature treatments (5 ℃)

3 讨论

低温胁迫是影响木薯生长发育和产量提高的重要限制性因素，培育耐低温品种是促进木薯北移的重要手段之一.植物多倍体具有植株粗壮、叶片增大、花器官增大和抗逆性强等特点，因而倍性育种具有很大的潜在商业价值[29,30,31].An et al[32]研究表明，木薯多倍体表现出植株粗壮、块根增大、叶片变厚、叶色变深，叶绿素含量和CAT、POD等酶活性均显著优于二倍体，在木薯耐寒育种中具有显著优势.

环指蛋白是一类重要的锌指蛋白，在应对环境刺激中起关键作用.木薯具有RFP特征结构的家族基因报道较少，而与低温胁迫相关的RFP家族基因的研究还未见报道.本研究从低温胁迫的木薯SC8组培苗中克隆到一个含C3H2C3-type Ring Finger基因MeRFP8.CDD分析显示MeRFP8氨基酸序列具有保守结构域Ring finger motif，属于植物RFP基因家族成员.聚类分析结果显示，木薯MeRFP8蛋白与麻疯树(XP_012070295.1)蛋白聚为一类，进一步验证了木薯与麻风树同属于大戟科，具有较近的亲缘关系.基因表达结果显示，SC8叶片中MeRFP8基因表达受5 ℃低温诱导4 h时表达水平最低，表达量是对照的0.27倍；随着处理时间的延长，表达量逐渐升高，但比对照时的表达水平低.这与硬粒小麦的低温响应基因TdRF1[33]表达模式相似，而与拟南芥AtAIRP1[34]，玉米ZmRFP1[35]和芜菁BrRZFP1[36]的低温响应基因表达模式相反(表达量先升高，随着处理时间的延长，表达量降低)；大豆GmRFP1基因在低温胁迫时则下调表达[37].而马铃薯SbRFP1基因在耐低温植株中的表达水平明显高于低温敏感型植株[22].本研究中MeRFP8在SC8及其同源四倍体，NZ199及其四倍体中先下调表达，后上调表达，且表达模式是一致的，但SC8中MeRFP8的表达受低温胁迫诱导的程度比SC8四倍体强.因此，推测木薯MeRFP8可能与马铃薯SbRFP1基因具有相似的功能，在低温响应中发挥作用.而从木薯块根中克隆的木薯MeRZF(AEQ20638.1)基因[23]，也含有RING-H2 zinc finger protein特征结构，但其氨基酸序列比本研究中的MeRFP8短，两个基因的同源性也很低，且MeRZF基因主要在干旱胁迫中起作用，推测MeRFP8和MeRZF虽然都含有RING-H2特征结构，但两者属于不同的家族，因此两者的同源性较低，且对不同的逆境起主要作用.

在后续研究中，将着重分析不同逆境处理下，SC8及其同源四倍体的生理参数以及MeRFP8蛋白的活性变化，采用酵母双杂交鉴定与MeRFP8互作的ABA和Glc信号通路；并试图通过转化MeRFP8活性形式验证MeRFP8的功能，希望建立木薯低温响应的泛素化信号途径，为开发抗寒分子标记辅助木薯抗寒种质的选育提供依据.

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(责任编辑:吴显达)

Cloning and expression of aMeRFP8 gene in cassava (ManihotesculentaCrantz)

XUE Jingjing, CHEN Songbi

(Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Conservation and Utilization for Cassava Germplasm Resources, Danzhou, Hainan 571737, China)

To investigate the role of ring finger protein in plant′s response to cold, a full-length cDNA sequence ofMeRFP8 was firstly cloned from cassava SC8 by RT-PCR. The results showed thatMeRFP8 gene contained a 1 065 bp open reading frame (ORF), and encoded 352 amino acid residues, with a predicted molecular mass of 39.23 ku and theoretical isoelectric points (pI) of 4.84. It had a conserved RING finger domain (Ring-H2 zinc finger) at the C-terminal region, which belonged to C3H2C3 type ring finger protein. Then expression levels ofMeRFP8 gene in cassava SC8 and its autotetraploid genotypes were analyzed using real-time RT-PCR. The results showed that the expression ofMeRFP8 in SC8 and its autotetraploid was firstly down-regulated and then up-regulated, presenting a “V” pattern during 24 h at 5 ℃. Moreover, expression level ofMeRFP8 gene was higher in SC8 than its autotetraploid. To summarize,MeRFP8 is likely to be involved in the low temperature response of cassava.

cassava; ring finger protein;MeRFP8; gene clone; cold-resistant

2015-10-22

2016-07-04

国家自然科学基金(31271776)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目(1630032013005).

薛晶晶(1983-)，女，助理研究员，博士.研究方向：木薯基因克隆和表观遗传学.Email：xuetao608@163.com.通讯作者陈松笔(1966-)，男，博士，研究员.研究方向：木薯蛋白质组学.Email：songbichen@hotmail.com.

S533

A

1671-5470(2017)01-0073-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.012