貉源致病性沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验分析

肖丽荣，李巧玲，张召兴，庞洪泽，张文举，吉志新，贾青辉，史秋梅

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛，066600)

沙门氏菌抗原性复杂、血清型多样、临床症状和病理变化多变，且多与病毒性疾病或其他细菌性疾病并发，该菌可以通过直接或间接方式进行传播，给畜牧业造成严重经济损失[1，2]。貉的沙门氏菌病又称为副伤寒，是由沙门氏杆菌感染而引起的急性及慢性传染病，症状主要表现为发热和腹泻，体质量迅速减轻，脾脏显著肿大和肝脏的病变，且经常出现母兽流产现象，呈地方性暴发流行[3]。抗生素是防治沙门氏菌主要的手段，在养殖过程中不合理的使用抗生素，导致出现耐药菌和多重耐药现象，其耐药谱也越来越广[4]。2017年5月中旬，秦皇岛市某养貉场发现断奶前后40～60日龄幼貉突然发病，有的呈现急性死亡。为了确定貉急性死亡的病原菌，分离1株病原菌，被鉴定沙门氏菌，该菌具有很强的致病性，因此对该分离菌株进行药敏试验，以期为该地区貉源沙门菌病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

秦皇岛市某养貉场40～60日龄幼貉约1 000只，发病率为5.0%，死亡率为2.7%，对送检的病死幼貉剖检，无菌采取病死貉的肝脏组织，进行分离鉴定。

1.2 主要试剂与仪器

普通琼脂培养基、营养肉汤、SS培养基、质量浓度为70 g/L的绵羊脱纤血液琼脂、革兰氏染色液试剂盒(引自青岛高科园海博生物技术有限公司)；药敏纸片(引自北京天坛药物生物技术开发公司)；ID32E肠道菌鉴定试条(引自法国梅里埃公司)； DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(均引自北京康为世纪生物科技有限公司)。常规仪器与试剂均由本实验室提供。

1.3 试验动物

体质量约20 g的昆明系小鼠10只，引自北京维通利华实验动物有限公司。

1.4 病原的分离纯化

无菌采集病死幼貉的肝脏组织，接种于质量浓度为70 g/L的绵羊脱纤血液琼脂培养，37 ℃恒温培养12～18 h，挑取优势单个菌落接种于SS琼脂培养基上。挑取优势菌落接种于普通营养琼脂培养基上进行纯化培养，挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中37 ℃恒温震荡培养12 h，并革兰氏染色，显微镜下观察细菌形态。

1.5 病原菌生化试验

按照ID32E肠道菌鉴定试剂条说明书操作，用ATB自动生化鉴定系统进行生化试验。

1.6 病原菌的16S rRNA PCR检测

将细菌纯培养产物按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，根据细菌16S rRNA序列设计的通用引物(由北京生工生物工程技术服务有限公司合成)，对细菌的16S rRNA基因片段进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为50 μL：2×Taq Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。取出5 μL扩增产物于质量浓度为10 g/L琼脂糖凝胶中，150 V电泳20 min，观察PCR扩增产物的条带，将PCR产物送北京生工进行序列测定，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性比较分析。

1.7 致病性试验

[5]的方法，对实验组小鼠腹腔接种菌液浓度为1×108CFU/mL，每只小鼠接种0.2 mL；对照组接种等量的营养肉汤作为阴性对照。接种12 h后，观察7 d，记录发病及死亡情况，对于死亡的小鼠剖检，无菌取其肝脏组织分离并鉴定。

1.8 药敏试验

按照美国临床检验标准委员会推荐的标准K- B纸片法进行操作和结果判断[6]。

2 结果与分析

2.1 病死貉剖检结果

剖检变化可见(图1 )，病死貉肝脏出血，切面外翻；脾脏多数高度肿胀，呈黑红色或暗褐色，被膜下出血；肾脏呈灰红色或带有淡黄色，被膜下见点状出血；肠系膜淋巴结肿大，质地柔软，呈灰红色或灰色。

2.2 分离菌株形态特征与培养特性结果

在SS琼脂培养基上生长出圆形光滑、边缘整齐、较扁平、无色但中心稍发黑的菌落，在普通营养琼脂培养基上生长出圆整、光滑、稍隆起、浅灰白色的菌落，在血液营养琼脂培养基上的菌落特征与在普通营养琼脂的一致，不溶血。涂片染色镜检，革兰染色呈散在、两端钝圆的直杆菌。

2.3 分离菌株的生化特性鉴定结果

分离菌株氧化酶，尿素酶，VP，苯丙氨酸和色氨酸脱氨酶，脂肪酶，DNA酶，丙二酸盐利用，吲哚等试验为阴性；酒石酸盐利用、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、接触酶、精氨酸双水解酶、硫化氢等试验阳性。经ATB自动生化仪鉴定分析系统检测分析，鉴定结果为沙门氏菌，评定结果合格率为99.9%。

2.4 分离菌株的16S rRNA测序

用16S rRNA的通用引物进行PCR扩增，分离菌株扩增出大约为1 492 bp的目的条带(图2)。将测序结果与GenBank基因序列数据库中基因序列进行比对，与已发表的沙门氏菌的基因序列同源性为100%，确定了分离菌株为沙门氏菌。

图1 病貉病理剖检结果

图2 貉源致病性沙门氏菌的分离菌株16S rRNA PCR扩增结果

2.5 致病性试验结果

实验组小鼠在攻毒24 h后出现死亡，将死亡小鼠剖检后，无菌采集肝脏组织进行分离鉴定，结果显示，分离到了沙门氏菌，对照组小鼠健康存活。表明分离菌株具有致病性。

2.6 药敏试验结果

通过药敏试纸片检测结果显示，该分离菌株对头孢曲松、头孢拉定、大观霉素、新霉素、替米考星等5种药物高度敏感；对恩诺沙星、氧氟沙星、阿米卡星、磺胺间甲氧嘧啶、诺氟沙星等5种药物中度敏感；对氟苯尼考、阿莫西林、氨苄西林、乙酰甲喹、环丙沙星、庆大霉素、多西环素、链霉素、林可霉素等9种药物耐药(表1)。

表1 貉源致病性沙门氏菌的分离菌株药敏试验结果

注：R为耐药，I为中介，S为敏感。

3 讨 论

沙门氏菌是革兰氏阴性、无荚膜、周身鞭毛、能运动的需氧或兼性厌氧的短杆菌[7，8]。沙门氏菌病又名副伤寒，是各种动物由沙门菌属细菌引起的疾病总称，临床上多变现为败血症和肠炎，也可使妊娠动物发生流产。肠道沙门氏菌是一种人畜共患病病原菌，在全球范围内分布广泛，对毛皮动物养殖行业造成了严重的危害[5]。沙门氏菌病的最大危害是垂直传播，部分妊娠母貉感染沙门氏菌可引起流产或产出死胎，其余的产出病貉或带菌貉。这些病貉或带菌貉的分泌物和排泄物中含有大量病菌，污染饲料、饮水等，从而传播给健康幼貉导致发病死亡。沙门氏菌携带多种毒力因子，如脂多糖、肠毒素、细胞毒素等，相关研究表明了这些毒力基因与致病性密切相关。需要进一步研究沙门氏菌毒力基因致病机理。本次试验的药敏试验结果显示，该分离菌株对头孢曲松、头孢拉定、大观霉素、新霉素、替米考星等5种药物高度敏感，对其他药物都有不同程度的耐药性。与陈思等[4]报道的貉源沙门氏菌对头孢曲松、头孢拉定、大观霉素等药物敏感一致。与李建军等[9]报道的有差异性，可能与分离的地区和血清型有关。

参考文献：

[1] 徐昊，孙海英，翟军军，等.大庆屠宰牛肉中沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].黑龙江八一农垦大学学报，2015，27(3)：36- 39.

[2] 张宗植,金鑫,金吉东,等.鹌鹑大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的病原分离与鉴定[J].延边大学农学学报,2002,24(2):114- 117.

[3] 陈薄言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2015.

[4] 狄文婷,杜雄伟,吴静,等.猪源沙门氏菌的分离与耐药性分析[J].江苏农业科学,2014,42(10):278- 280.

[5] 陈思，吕文雪，许皓，等.貉沙门氏菌病的诊断及病原分离鉴定[C]//杨福合.中国毛皮动物科学研究进展——2014年全国毛皮动物专业学术研讨会论文集.长春:吉林科学技术出版社,2014.

[6] National Committee for Clinical Laboartory Standards,Perfomrance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from animals:approved standard,seconded,NCCLS document M31- A2[S].USA:Wayne,2000,49(21):105- 126.

[7] 沈学怀，翟银建，张丹俊，等.散养鸡鼠伤寒沙门氏菌的分离·鉴定·耐药性研究[J].安徽农业科学，2016，44(27):110- 113，211.

[8] Yang B W,Qu D,Zhang X L,et al.Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi, China[J].International Journal of Food Microbiology,2010,141(1/2):63- 72．

[9] 李建军,李丰宜,吕春艳,等.貉沙门氏菌病的诊治[J].中国畜牧兽医,2007,34(2):125- 126.