坝上长尾鸡IL- 2基因克隆与生物信息学分析

闫艳娟，李蕴玉，李佩国

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛，066600)

白细胞介素2(interleukine- 2,IL- 2)是一类重要的淋巴因子，主要是由T- 淋巴细胞产生[1]。可促进哺乳类动物B细胞、T细胞的增殖、分化，还可以增强单核细胞和NK细胞的杀伤活性，在免疫系统具有十分重要的免疫生理调节效应，甚至可对神经系统发挥免疫调节作用[2]。1983年，T. Taniguchi 等[3]首次成功克隆人的IL- 2 基因，而后至少有30多个物种的IL- 2基因被相继克隆成功。与人类和哺乳动物的IL- 2研究相比，鸡IL- 2基因的研究比较滞后。一直到1997年，Sundick 等[4]首次获得了鸡IL- 2基因，使鸡IL- 2的研究步入分子水平。鸡IL- 2基因不仅在鸡病防治和免疫方面有重要作用，还可以作为一种天然功能的细胞因子作用于动物，不存在动物产品的安全问题[5]。依据GenBank中的鸡IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，采用RT- PCR 方法扩增鸡的IL- 2基因，并与GenBank 中所发表的序列如Leghorn SPF鸡[6]、Kestrel来航鸡、broiler鸡、Obese鸡、萧山鸡、猫、牛[7]、山羊[8]、人[9]的序列同源性进行比对，对氨基酸序列进行预测。坝上长尾鸡距今已有300年的历史，是唯一被列入中国畜禽遗传资源志的地方品种，它是肉蛋兼用型的品种鸡，具有耐粗饲、抗寒、抗病力强、肉味美等特点[10]，在市场上具有很高的需求，其产品具有非常广阔的前景，因此对坝上长尾鸡IL- 2基因的生物信息学进行分析，为进一步研究鸡IL- 2基因的生物学功能、分子生物学和开展鸡IL- 2 基因工程方面的研究提供依据，以及更好地对坝上长尾鸡进行品种保护。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50日龄坝上长尾鸡(BSCW)，由河北科技师范学院牧场提供。

1.2 主要仪器及试剂

eppendorf AG梯度PCR仪，由德国艾美德公司生产；德国Hettich公司生产的台式高速冷冻离心机，型号为MIKRO220R；大肠杆菌DH5α感受态细胞，pMD18- T Vector，trizol，Tag酶，DL2000 Marker，反转录试剂盒，限制性内切酶(Hind Ⅲ，BamH Ⅰ)等试剂，由TaKaRa公司生产；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，由天根生化科技(北京)有限公司生产。

1.3 BSCW鸡脾脏总RNA 的提取

鸡颈部放血致死，无菌采取脾脏组织，用液氮研磨，然后加trizol试剂1 mL，一步法提取鸡脾脏总RNA，具体方法参照文献[11]。

1.4 BSCW鸡IL- 2基因的RT- PCR扩增

依据GenBank中的鸡IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，利用Primer5.0设计1对特异性引物，引物序列P1：5’- CCGAATTCATGATGTGCAAAGTACTG- 3’，P2：5’- ATGCGGCCGCCCGCGGGGATCCACGCGT-TTTTTGCAGATATCTCACAAAG- 3’。使用反转录试剂盒反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR 扩增，反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。用质量浓度10 g/L的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.5 IL- 2基因的克隆

对上述的PCR产物进行回收，取4.5 μL与载体pDM18- T Vector 0.5 μL相连接，并加入SolutionⅠ5.0 μL，16 ℃连接4 h。经DH5α感受态细胞转化，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选培养，挑取阳性菌落进而提取重组质粒。

1.6 重组质粒的鉴定

用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ对提取的重组质粒进行双酶切鉴定及PCR鉴定。

1.7 BSCW鸡IL- 2基因的序列测序和分析

经含有氨苄青霉素的LB平板筛选得到的阳性菌落在液体LB中摇菌后菌液直接送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，应用DNAstar，MEGA 5.1，DNAMAN等软件对测序的BSCW鸡IL- 2基因进行同源性比较及进化树分析。

1.8 BSCW鸡IL- 2基因编码蛋白质的生物信息学分析

利用ProtParam，DNAstar，Swiss Model 等软件对BSCW鸡IL- 2 基因编码蛋白质的理化性质、疏水性、二级结构和三级结构进行预测。

2 结 果

2.1 RT- PCR扩增结果分析

用质量浓度10 g/L的琼脂糖电泳对RT- PCR扩增产物进行分析，可见一条长度约为432 bp的条带，与预期基因片段大小相同(图1)。

图1 BSCW鸡IL- 2基因RT- PCR扩增

2.2 IL- 2 基因的克隆与重组质粒的鉴定

对筛选到的阳性重组质粒pMD18- T- IL- 2进行PCR鉴定及BamH Ⅰ，Hind Ⅲ双酶切鉴定。PCR鉴定可见在432 bp的位置有特异性条带，双酶切鉴定显示有2条条带(图2，图3)，一条长度约为432 bp，另一条长度约为2 600 bp的载体片段，说明BSCW鸡IL- 2基因成功克隆到pMD18- T载体中。

2.3 BSCW鸡IL- 2基因序列测定及分析

双酶切鉴定为阳性的重组质粒测序结果表明，BSCW鸡IL- 2基因CDS区全长432 bp，含有1个432 bp的开放阅读框(ORF)，编码143个氨基酸，与GenBank中序列相比有6个碱基发生了突变(图4)。用DNAMAN 软件将克隆得到的BSCW鸡IL- 2氨基酸序列与GenBank中发表的鸡IL- 2氨基酸序列进行比对，在28，30，32，120 位有4个氨基酸的差异(图5)。

图2 重组质粒的PCR鉴定 图3 pMD18- T- IL- 2重组质粒的双酶切鉴定

图4 BSCW鸡IL- 2基因测序结果

图5 BSCW鸡IL- 2氨基酸序列与GenBank中鸡IL- 2氨基酸序列对比

2.4 BSCW鸡IL- 2基因的同源性比较及进化树分析

克隆得到的BSCW鸡IL- 2基因与GenBank中发表的鸡IL- 2的核苷酸序列同源性为95%，氨基酸同源性为97.2%；与Leghorn SPF鸡、Kestrel来航鸡、broiler鸡、Obese鸡、萧山鸡、猫、牛、山羊、人的IL- 2核苷酸序列同源性分别为98.1%，95.0%，94.1%，93.9%，94.1%，45.3%，48%，47.5%，41.7%(图6)，与其氨基酸序列同源性分别为97.2%，96.7%，8.1%，9.6%，94.7%，12.3%，14.1%，17.1%，10.2%(图7)。从进化上看，BSCW鸡的IL- 2基因与Leghorn SPF鸡、Kestrel来航鸡、broiler鸡、Obese鸡、萧山鸡距离比较近(图8)，与其他哺乳动物的IL- 2基因距离比较远(图9)。

图6 IL- 2基因的同源性比较

图7 IL- 2基因推导的氨基酸序列的同源性比较

图8 IL- 2基因序列的进化树分析

图9 IL- 2基因推导的氨基酸序列的进化树分析

2.5 BSCW鸡IL- 2基因编码的蛋白质生物信息学分析

2.5.1IL-2基因编码的蛋白质的理化性质及疏水性预测 应用ProtParam软件对IL- 2蛋白分子进行分析可知，分子质量为37 499.95 ku，理论等电点(PI)为5.24，分子式为C1 393H2 330N458O570S90。序列中带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)有20个，带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)有19个。该蛋白的半衰期为4.4 h，不稳定系数为48.23，为不稳定蛋白；该蛋白脂溶性为36.03，平均亲水指数为0.89，该蛋白为亲水蛋白。

2.5.2IL-2基因编码的蛋白质的二级结构预测 通过DNAStar对IL- 2 基因推导的氨基酸序列进行蛋白质二级结构预测及抗原性分析，结果显示，IL- 2基因推导的蛋白的空间结构具有6个α螺旋，4个β折叠，10个转角和3个无规则卷曲(图10)。疏水性分析发现，IL- 2基因推导的蛋白质具有较强的亲水性，只有一个强疏水位点，在第10，第11位氨基酸处。

2.5.3IL-2基因编码的蛋白质的三级结构预测 该蛋白三级结构与二级结构预测基本一致，主要由6个α螺旋结构和4个β折叠构成(图11)。

图10 IL- 2基因编码的蛋白质的二级结构预测

图11 IL- 2基因编码的蛋白质的三级结构预测

3 结论与讨论

通过对BSCW鸡IL- 2基因与另外几种脊椎动物的IL- 2核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较和进化树分析，结果表明，测出的BSCW鸡的IL- 2基因与GenBank上发表的IL- 2基因的同源性分别为95.0%和97.2%。从进化上分析，二者在进化树上的距离较为接近，说明在系统进化过程中在相同的分支上，亲缘关系相对较近；与其他种属的同源性较低，亲缘关系较远。

IL- 2主要是由T淋巴细胞产生的一类细胞因子，在免疫调节、抗病毒及感染性疾病的治疗中都有重要作用。依据GenBank中发表的鸡IL- 2基因的高度保守区序列，通过Primer 5.0软件设计一对特异性引物，克隆IL- 2基因的开放阅读框，结果显示，由432个核苷酸组成，编码143个氨基酸。测序结果也证实成功克隆了IL- 2基因，为进一步研究IL- 2基因的生物信息学功能及作为DNA疫苗的免疫增强剂提供依据。与GenBank上发表的IL- 2基因序列相比，克隆得到的序列有6个碱基发生变异，这6个碱基的变异导致编码的蛋白序列有4个氨基酸发生变异。

通过分子生物学软件对BSCW鸡IL- 2基因所编码的蛋白质进行了理化性质、疏水性、二级结构及三级结构预测分析。理化性质显示，编码的蛋白质相对分子质量为37 499.95 ku，等电点为5.24。疏水性结果显示，推导的蛋白质具有很好的亲水性，有1个强疏水位点，在第10，第11位氨基酸处。二级结构预测结果分析显示，该基因编码的蛋白质具有6个α螺旋，4个β折叠，10个转角和3个无规则卷曲的复杂结构。三级结构预测得到的结果和二级结构一致。

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