不同方法检测霉菌毒素的比较研究

董艾青， 刘少文， 柏 凡， 陈 宇， 郭春华， 柏 雪*

（1.西南民族大学生物科学与技术学院，四川成都 610041；2.农业部饲料质量监督检验检测试中心（成都），四川成都 610041）

不同方法检测霉菌毒素的比较研究

董艾青1， 刘少文1， 柏 凡2， 陈 宇1， 郭春华1， 柏 雪1*

（1.西南民族大学生物科学与技术学院，四川成都 610041；2.农业部饲料质量监督检验检测试中心（成都），四川成都 610041）

本研究通过比较三种不同方法对霉菌毒素检测结果的差异，旨在为检测霉菌毒素提供科学依据。本实验采用酶联免疫（ELISA）试剂盒、超高效液相色谱（UHPLC）和液相质谱质谱联用（HPLC-MS/MS）三种检测方法，对仔猪配合饲料中黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、呕吐毒素（DON）含量进行检测。ELISA法检测AFB1、ZEA和DON时，超标率与UHPLC法和HPLC-MS/MS法接近；但ELISA法检测AFB1结果为限量值为80%以上时，采用UHPLC法的检测结果显著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其他所有样品的AFB1、ZEA和DON两种仪器检测方法差异不显著（P＞0.05）。ELISA可作为霉菌毒素检测的快速初筛法；对ELISA结果进行确认时，低含量AFB1样品更宜采用HPLC-MS/MS法，其余样品采用UHPLC法检测更经济；对DON和ZEA的ELISA结果确认时，也可采用UHPLC法。

ELISA试剂盒；UHPLC；HPLC-MS/MS；仔猪配合饲料；霉菌毒素

霉菌毒素对饲料和粮食的污染问题已成为不可忽视的重大难题。Akande（2006）报告显示，全世界每年受霉菌毒素污染的作物约占总量的25%。Sulyok（2006）调查结果显示，受污染的作物中霉菌毒素就有300～400种。我国饲料与粮食中霉菌毒素的污染也不容小觑。程传民（2014）的研究数据表明，我国小麦呕吐毒素（DON）检出率达94.8%；龚阿琼（2015）的研究结果显示，饲料原料中AFB1的检出率为95.5%，最低的玉米赤霉烯酮（ZEA）检出率也接近90%；季海霞（2015）对饲料原料检测显示，AFB1检出率超过90%，ZEA、DON接近全检出，玉米副产物中ZEA检出率高达1518.18μg/kg，DON检出率更是高达4402.69 μg/kg，超标率分别为12.25%和51.09%，污染较为严重。2006—2012调查结果显示，3种霉菌毒素的检出率均有下降趋势，超标率却没有明显下降，AFB1超标率反而有上升趋势 （周闯等，2014；敖志刚等，2008）。

目前饲料中霉菌毒素的检测方法比较多，可以分为快速筛选法和基准方法。快速筛选方法以荧光光度计法、ELISA法较为常用。基准方法包括液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法、近红外光谱法和荧光检测法等。ELISA试剂盒法是目前运用最多的霉菌毒素检测方法，此法具有操作简便、成本低、检测快速等优点，但是特异性较差，有假阳性等情况出现。UHPLC应用也较普遍，是目前国际上使用最广泛的霉菌毒素检测方法，但是使用繁琐、成本较高，不适用于现场快速和大量的样品筛选。HPLC-MS/ MS能够对饲料及食品中霉菌毒素、兽药残留、非法添加物等进行痕量和超痕量分析，且基本没有假阳性现象出现，是检测的理想方法，但仪器和耗材昂贵，对检验人员技术要求也较高。

基于检测方法在畜牧饲料行业中的重要性，本实验利用不同的检测方法对仔猪配合饲料中霉菌毒素进行检测比较，分别评价不同方法对不同霉菌毒素的检测效果，为寻找一套简便、快速、准确的霉菌毒素检测方法提供科学依据，以确保检测结果更加准确。

1 材料与方法

1.1 样品采集 严格按照 GB/T 14699.1-2005《饲料采样》标准，从四川、重庆等地的饲料厂采集具有代表性的仔猪配合饲料33份。

1.2 仪器与试剂 主要试剂：ELISA试剂盒（Romer Labs Gmbh公司）；多功能净化柱（MycospinTM400）；乙腈，色谱级（≥99.9%）；甲醇，色谱级（≥99.9%）；正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素标准液，均购自国家标准物质中心，保存条件为2～8℃；吐温；超纯水（UP级）。

主要仪器：超高效液相色谱仪 （型号：ACQUITY UPLCM-Class，ACQUITYWATERS公司，美国）；液相质谱质谱联用仪 （型号：1290/6460，Agilent公司，美国）；DNM-9602酶标分析仪；优普超纯水制造系统（型号：ULUP®-I-5/10/20T，优普超纯科技公司，中国）；XH-B型旋涡混合器；DH-250型电热恒温培养箱；台式高速冷冻离心机；HS-501振荡器；电子天平；隔膜真空泵（型号：GM-0.33A）；氮吹仪。

1.3 检测指标及方法 利用ELISA法、UHPLC法和HPLC-MS/MS法对配合饲料中AFB1、ZEA 和DON含量进行测定。ELISA法参照操作说明书进行；UHPLC法检测：AFB1检测参考 GB/T 30955-2014标准，ZEA参考GB/T 28716-2012标准，DON参考GB/T 30956-2014标准；HPLC-MS/ MS法：AFB1、ZEA具体参考标准 NY/T 2071-2011，DON参考标准SN/T 3136-2011。

1.4 液相色谱条件 色谱柱：C18柱，柱长为100 mm，内径2.1 mm，粒度2.4μm或类似色谱柱；柱温：35℃；进样量：5μL；流速：0.3 mL/min；流动相、梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱仪的梯度洗脱条件参数

1.5 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；扫描方式：正负离子同时进行的扫描模式；毛细管电压：正模式（4000 V）；负模式（3500 V）；干燥气流速：13 L/min；干燥气温度：350℃；雾化气压力：40 psi。

1.6 限量标准 国家限量标准：AFB1根据GB 13078-2001饲料卫生标准 （AFB1≤10μg/kg），ZEA参考 GB 13078.2-2006饲料卫生标准（ZEA≤100μg/kg），DON参考GB 13078.3-2007饲料中呕吐毒素的国家标准（DON≤1000μg/kg）。当霉菌毒素含量大于或等于80%限量时，该样品认定为高含量样品；当霉菌毒素含量低于50%限量时，该样品认定为低含量样品；含量位于两者之间的样品为中含量样品。

1.7 数据处理 实验数据采用SPSS 18.0进行二样本配对T检验。其中P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同检测方法间AFB1的检测结果比较 由表2可看出，ELISA法检测出饲料样品中AFB1超标率为18.18%，高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法（15.15%和12.12%），最大值也高于另外2种方法的检测结果。AFB1低含量的样品三种检测方法之间差异不显著（P＞0.05），但对于中含量和限量值80%以上的样品，ELISA法检测结果均显著或极显著高于其他两种检测方法（P＜0.01）。从整体来看，ELISA法检测样品的总体平均值极显著高于UHPLC法（P＜0.01），但与HPLC-MS/MS法之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同检测方法下仔猪饲料中AFB1的结果μg/kg

两种检测方法仅在检测ELISA结果为限量值 80%以上的样品时，UHPLC法显著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其余情况两种方法检测结果差异不显著 （P＞0.05），但绝对数值HPLC-MS/MS法高于UHPLC法，特别是低含量样品，HPLC-MS/MS法结果为UHPLC法的6倍。

2.2 不同检测方法间ZEA检测结果的比较 由表3可看出，UHPLC法与HPLC-MS/MS法检测超标样品超标率均为39.39%，低于ELISA法（42.42%），最高值也同样低于ELISA法。

表3 不同检测方法下仔猪饲料中ZEA的结果μg/kg

ELISA法检测ZEA低含量和中含量的样品时，其结果接近UHPLC和HPLC-MS/MS法的两倍，但由于标准差较大，三种方法检测结果差异不显著（P＞0.05）；检测高含量样品时，ELISA法显著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS测定方法（P＜ 0.05）。但无论样品中ZEA含量多少，两种检测方法之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 不同检测方法间DON检测结果的比较由表4可看出，ELISA法检测DON的超标率低于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，分别为33.33%、36.36%和36.36%，且最高值仅为两种方法的50%左右。

表4 不同检测方法下仔猪饲料中DON的结果μg/kg

从总体平均值来看，三种方法检测仔猪配合饲料中DON含量时差异不显著 （P＞0.05）。但ELISA法检测值为低含量的样品，其ELISA法检出结果显著高于UHPLC法和HPLC-MS/ MS法（P＜0.05）；中含量样品检出结果显著高于HPLC-MS/MS法 （P＜0.05），检测限量值80%以上的样品结果显著低于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），两种方法在检测DON时差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

在实际生产中，采用UHPLC仪器检测霉菌毒素成本太高，ELISA试剂盒法又受温度、试剂盒品牌、酶标仪灵敏度等条件影响，假阳性率较高，可重复性差。这两类方法各有其优缺点，寻找一种相互弥补、稳定快捷又价格低廉的检测模式是检测部门和饲料厂的共同目标。

本研究发现ELISA法测定AFB1、ZEA的平均值均显著高于UHPLC法，这和柳洁等（2005）在检测粮油食品中AFB1含量时的结果一致。ELISA法检测低含量的AFB1样品时，三种方法检测结果一致，陈建伟（2012）研究也认为HPLC法和 ELISA法测定玉米中 AFB1含量在0.2～200μg/mL时，两种方法相当。样品中毒素的浓度是影响检测结果的重要因素之一。当样品中AFB1含量较高时，ELISA法检测结果显著高于其他方法，这可能与ELISA法检测原理有关。范素芳等（2011）认为检测玉米等粮食中AFB1的含量时，HPLC法的精密度和灵敏度都弱于HPLC-MS/MS法。本研究也发现两种仪器检测方法在检测低含量和中含量样品时，UHPLC法检测结果低于HPLC-MS/MS法。而当样品含量较高时，UHPLC法检测结果高于HPLC-MS/MS法。杨水艳等（2015）认为，在使用HPLC-MS/MS法测定AFB1时，当样品中AFB1含量较高时，会降低其回收率，这也可能是导致上述结果的原因之一。

当ELISA法检测ZEA样品时，其结果均显著高于其他两种测定方法，ELISA法检测DON值为低含量和中含量的样品时，ELISA法检出结果也显著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，这与佘容（2015）和贾卫昌（2015）等人的研究结果一致。ELISA法检测高含量DON的样品时，检测结果却显著低于其他两种方法，这与佘容等（2015）研究结果相反，原因可能与选择的试剂盒差异有关，试剂盒检测结果出现的假阳性也可能是原因之一 。陈玲（2006）和古莉（2015）等人对造成ELISA试剂盒假阳性和不稳定的因素进行了研究，大致归纳为以下几点：（1）饲料样品溶解液的pH值。为防止仔猪腹泻与促消化，一般添加的酸含量较高，而极端的酸碱环境可影响酶的化学结构，当溶解液pH低于5.0时，酶结构会发生不可逆性变化，导致后续酶联反应受影响，出现假阳性。（2）饲料中的微量元素含量过高时，能够破坏酶的化学结构，同样影响底物的颜色反应，出现假阳性。（3）饲料中的脂肪可能包裹抗体，影响抗原-抗体的特异性结合，反应的终止时间受干扰，出现假阳性。但值得注意的是，试剂盒检测值并不一定都比上机检测值高。说明试剂盒在检测霉菌毒素含量时，稳定性不及色谱法和质谱法。

4 结论

本研究结果表明，三种检测方法对DON的检测结果差异不显著，出于成本与快速检测结果考虑，DON更适合使用ELISA试剂盒检测。在检测AFB1和 ZEA时，ELISA试剂盒结果显著高于UHPLC法与HPLC-MS/MS法，ELISA试剂盒进行AFB1和ZEA检测时只适合用作初筛。在采用仪器对AFB1进行确认时，低含量样品更宜采用HPLC-MS/MS法；其他含量的样品出于成本考虑可选择UHPLC法。对DON和ZEA结果确认时，也可选择较经济的UHPLC法。

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The study was conducted to investigate the difference of three differentmethods to detect concentrations of mycotoxins，aims to give references aboutmycotoxins detection.A total of 33 piglet dietswere selected to detectmycotoxins aflatoxins B1（AFB1），zearalenone（ZEA）and deoxynivalenol（DON）concentrationswith differentmethods including ELISA，ultra performance liquid chromatography（UHPLC）and liquid chromatographmass spectrometermass spectrometer（HPLCMS/MS）.The over standard rate of ELISA method on detection of AFB1，ZEA and DON was same with UHPLC and HPLCMS/MSmethods，and the ELISA could be the preliminary screeningmethod.When the concentration of AFB1in piglet feed was 80%higher than limited value with themethod of ELISA，the UHPLC detected AFB1concentration was higher than that of HPLC-MS/MS（P＜0.05）.While there were no significant difference in UHPLC and HPLC-MS/MS on concentrations of AFB1，ZEA and DON on other samples（P＞0.05）.Itwas indicated that ELISA could be the preliminary screening method to detect themycotoxins concentrations.HPLC-MS/MS could be used to verify the results of ELISA method with lower AFB1concentration，while others were verified by UHPLC method.UHPLC could be used to verify the results of ELISA on concentration of DON and ZEA.

ELISA kits；UHPLC；HPLC-MS/MS；piglet feed；mycotoxins

S816.17

A

1004-3314（2017）04-0027-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170407

西南民族大学研究生创新科研项目（CX2015SZ087）

*通讯作者