酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料

王雅波，刘占英，兰 辉，李永丽，刘艳新

（内蒙古工业大学化工学院，内蒙古呼和浩特 010050）

资源开发利用

酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料

王雅波，刘占英*，兰 辉，李永丽，刘艳新

（内蒙古工业大学化工学院，内蒙古呼和浩特 010050）

玉米皮是玉米加工过程中的主要副产品，其营养价值丰富，可作为缓和资源短缺和降低工业成本的优质饲料来源，但目前各玉米淀粉厂对其的综合利用不够完全，导致部分资源浪费。本文采用饲料国标测定法对玉米皮中纤维素类等有效成分进行测定，并以玉米皮为原材料，采用毕赤酵母菌2.3250发酵的方法降解玉米皮中的纤维素类物质，使其充分转化为高附加值的饲料蛋白。结果表明：玉米皮中的纤维素和半纤维素含量分别为16.40%和47.68%，蛋白质含量为11.49%，淀粉含量为15.50%，脂肪含量为2.73%，木质素含量为5.41%。另外，利用毕赤酵母菌转化玉米皮时，在无蛋白胨添加的情况下，25℃恒温培养48h，毕赤酵母菌浓度最高，为2.31×107个/m L。经过微生物发酵，玉米皮中纤维素含量由16.40%降到6.22%，半纤维素含量由47.68%降到33.45%。该研究对玉米皮的重要组分进行了系统分析，为利用酵母菌发酵玉米皮生产高附加值的菌体蛋白饲料等后续研究奠定了基础。

玉米皮；酵母；菌体蛋白饲料

玉米是我国的主要粮食作物之一，我国现今拥有几百家玉米淀粉加工厂。玉米皮是玉米淀粉加工的主要副产物之一，大约占玉米总质量的12%（史建国，2007），但玉米皮并未得到充分利用，产品附加值极低，导致主产品成本增高，利润率下降，市场竞争力变弱及社会效益降低等。因此更深层次的开发利用玉米的深加工副产物玉米皮（丁声俊，2011），可带动玉米加工企业的经济效益。与此同时，因饲料工业存在饲料蛋白供不应求的现象，仅依靠生产以往使用的蛋白类饲料根本无法满足饲料生产迅速发展的需求，而发展微生物饲料蛋白是满足其需要的有效途径之一 （代养勇等，2011），并且玉米皮是该产业的首选原材料。孙付保等（2010）利用混合菌株固态发酵玉米皮生产饲料蛋白，张博润等（1997）利用白地霉Z-4、热带假丝酵母Z-14和木素木霉Z-203菌株混合发酵白酒糟生产饲料蛋白，但这些产纤维素酶的微生物大多数是真菌，而酵母菌与其相比更具色、香、味和较高的蛋白质含量，发酵过程中耐酸能力强，不易污染，回收率高等优点，是生产微生物蛋白饲料的首选菌种（陈晓萍，2009）。因此，本文利用酵母菌将玉米皮转化为优质饲料，旨在有效利用玉米皮的营养成分，为菌体蛋白饲料研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料 玉米皮购于内蒙古阜丰科技有限责任公司，其他化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 菌种 毕赤酵母菌，为本实验室前期筛选得到的最佳菌种。

1.1.3 仪器与设备 高效液相色谱Water 1515；色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm id，9μm）；RI示差检测器；流动相：8 mmol/L H2SO4；进样体积：20μL；流动相流速：0.5 mL/min；柱温：40℃。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米皮成分的测定

纤维素、半纤维素含量的测定：范式测定纤维含量法（冯继华等，1994）。

木质素含量的测定：饲料中酸性洗涤木质素的国标测定方法（GB/T 20805-2006）。

粗蛋白质含量的测定：饲料中粗蛋白质的国标测定方法（GB/T 6432-94）。

淀粉含量的测定：测淀粉含量的国标方法—酶水解法（郭冬生等，2007）。

脂肪含量的测定：测脂肪含量的国标方法—索氏提取法（GB/T 6433-2006），以及酸水解法（李秀花，1994）。

1.2.2 酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白 厌氧培养需取24个30mL西林瓶，称取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸馏水；好氧培养需取24个100 mL三角瓶（提前洗净，烘干），均称取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸馏水，盖胶塞，压铝盖后放入1.5 MPa，121℃压力锅中灭菌。在操作前，需先在超净工作台内杀菌30min，再接入1.5mL酵母菌液（5%接菌量），置于25℃，150 r/min的培养箱内培养菌种。每24个瓶培养一个时间梯度，分别为24、48 h。观察不同培养时间和需氧情况对毕赤酵母菌体的影响。

1.2.3 微生物饲料中菌体浓度测定 将培养好的菌液置于振荡器上振荡5 min，使菌落脱离玉米皮。再将菌液倒入离心管中，3000 r/min离心5min（张国华等，2008）。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度计内，测定OD560。

1.2.4 微生物饲料中菌体数测定 由于原菌液浓度太大，给计数带来极大不便，故需预先稀释。本次所采用的稀释方法为：准备数个装有9 mL蒸馏水30mL西林瓶，取1mL菌液添加到一个西林瓶中，依此梯度稀释5个浓度，考虑到在操作过程中容易染菌，所以使用压过盖的西林瓶稀释，然后再利用血球板计数（沈萍等，2007）。

1.2.5 乙醇产量的测定

1.2.5.1 流动相配制 先用抽滤瓶抽取少量二次水，清洗抽滤瓶内壁，将清洗后的水倒出。再用抽滤瓶抽取约1000 mL二次水后，再用超声波清洗器超声0.5 h，之后将其内的屈臣氏水加入到仪器储液瓶中。

1.2.5.2 标准样品的配置 乙醇2 g，72%的硫酸溶液5mL，最后用二次水稀释到1 L。

1.2.5.3 样品溶液的配制 取培养好的菌液上清液950μL和50μL的10%的硫酸溶液加入到离心管中，4℃、15000 r/min冷冻离心3min。取出上清液置于另一离心管中，在上述同样的条件下再离心3 min，同样取出上清液经0.22μm水相过滤头过滤后置于进样瓶中，开始测样。

2 结果与分析

2.1 玉米皮组分的分析 玉米皮组分含量见表1，纤维素含量约为24.80%、半纤维素含量为47.68%、蛋白质含量为 11.49%、淀粉含量为15.50%、脂肪含量为2.73%以及木质素含量为5.41%。这与Palmarola-Adrados等（2005）的研究近乎相同。

2.2 酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白

2.2.1 培养条件对菌种浓度的影响 由表2可知，厌氧条件下培养48 h时，毕赤酵母菌体个数为2.31×107个/mL，相较于其他培养条件下，菌体浓度最高。

表1 玉米皮组成及含量%

表2 培养条件对菌体浓度的影响

2.2.2 蛋白胨添加量对菌种浓度的影响 由表3可知，蛋白胨添加量为0 g时，毕赤酵母菌体数量为2.31×107个/mL，高于其他条件下培养的菌体数量。

表3 蛋白胨添加量对菌种浓度的影响

2.2.3 纤维素与半纤维素的降解率 通过以上试验结果得知，在以玉米皮为底物时，厌氧培养48 h以后的菌液浓度明显高于24 h的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，所以对该条件下培养后的剩余培养基中的纤维素和半纤维素成分进行测定，结果见表4。

表4 纤维素和半纤维降解率%

经过微生物发酵，玉米皮中纤维素含量由16.40%变到6.22%，半纤维素含量由47.68%变到33.45%，说明毕赤酵母菌使玉米皮中的纤维素和半纤维素得以降解，供己所需，这可能是由于毕赤酵母菌产生某种可降解纤维素的酶。随着营养成分的不断增加，菌体浓度也会随之上升，与培养48 h菌体浓度高于24 h结论一致。

2.2.4 乙醇产量 经高效液相色谱测定，得到并无乙醇产生。

3 讨论与小结

Javed等（2012）研究发现，玉米皮中含有丰富的纤维类物质，其中包括有30%～50%的半纤维、10%～20%纤维素以及微量的木质素。本试验结果表明，玉米皮中的纤维类物质含量很高，其中纤维素含量为16.40%，木质素含量为5.41%，而半纤维素含量高达47.68%，淀粉含量为15.50%，蛋白质含量为11.49%，在测量时会因原料的产地及种类不同略有差异。另外，毕赤酵母菌可以有效的发酵玉米皮，通过显微镜直接计数法和分光光度法均证实，在以玉米皮为底物时，厌氧培养48 h以后的菌液浓度明显高于24 h的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，这一现象可能是由于在起初接入毕赤酵母菌时，首先会利用一部分木糖维持，以致培养前期酵母处于延迟期生长，菌体数目增加不明显，同时木糖的消耗较少（陈晓萍，2009）；培养后期酵母处于指数生长期，酵母数急剧增加，同时开始消耗玉米皮中的纤维素。对剩余培养基成分进行测定发现，玉米皮中纤维素含量由16.40%降到6.22%，半纤维素含量由47.68%降到33.45%，远高于乔君毅（2008）研究的纤维素和半纤维素的降解率水平，达到了玉米皮成分得以转化的效果，在发酵过程中并未产生乙醇等影响饲料生产的有毒物质，符合其作为微生物饲料的基本要求。

[1]陈晓萍.副产物玉米皮固态发酵高值化的研究：[硕士学位论文][D].无锡：江南大学，2009.

[2]代养勇，董海洲，王志刚，等.我国玉米深加工产业现状及发展趋势[J].中国食物与营养，2011，17（4）：37～39.

[3]丁声俊.发展玉米深加工业应掌握适度 [J].粮食与食品工业，2011，18 （4）：1～4.

[4]冯继华，曾静芬，陈茂椿，侯正高.应用VanSoest法和常规法测定纤维素及木质素的比较[J].西南民族学院学报（自然科学版），1994.1.

[5]郭冬生，彭小兰.蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究[J].湖南文理学院学报（自然科学版），2007.3.

[6]李秀花.酸水解法测定食品中脂肪含量与索氏抽提法的比较[J].山西医科大学学报.1999，4.

[7]乔君毅，亢晋，张福元，等.黑曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶的研究[J].饲料研究，2008，12：63～66.

[8]沈兆兵，刘晓洁，刘莉等.拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052发酵玉米皮生产丁醇[J].2014，5：361～367.

[9]沈萍，陈向东.微生物学实验[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[10]史建国.基于SPCE061A型单片机的食品螺杆膨化机温度的检测与控制：[硕士学位论文][D].济南：山东大学，2007.

[11]孙付保，陈晓旭，陈晓萍等.混合菌株固态发酵玉米皮生产饲料蛋白[J].食品与生物技术学报，2010，29（6）：916～920.

[12]王良仓.玉米皮的综合利用[J].中文信息，2013.6.

[13]张国华，考桂兰，李宝栋，等.酵母菌紫外诱变时洗涤液与离心转速的选择[J].畜牧与饲料科学，2008，29（3）：40～42.

[14]张博润，刘玉方，何秀萍等.发酵饲料蛋白的培养条件及产物分析[J].微生物学报，1997，37（4）：281～284.

[15]GB/T 20805-2006饲料中酸性洗涤木质素（ADL）的测定.

[16]GB/T 6432-94饲料中粗蛋白的测定方法.

[17]GB/T 6433-2006/ISO 6492：1999饲料中粗脂肪的测定.

[18]Holguin-Acuna A L，Carvajal-M illan E，Santana-Rodriguez V，et al. M aize bran/oat flour extruded breakfast cereal：A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant[J].Food Chem istry，2008，111（3）：654～657.

[19]Javed M M，Zahoor S，Shafaat S，et al.W heat bran as a brown gold：Nutritious value and itsbiotechnological applications[J].African Journal of M icrobiology Research，2012，6（4）：724～733.

[20]M endonça S，Grossmann M V E，VerhéR.Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks[J].LWT-Food Science and Technology，2000，33（1）：2～8.

[21]Palmarola-Adrados B，Borska P C，Galbe M，et al.Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat bran[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：843～50.

[22]W u Y V，Norton R A.Enriehment of Protein，starch，fat，and sterol ferulates from corn fiber by fine grinding and air elassifieation[J].Industrial Crops and Produets，2001，14（2）：135～13.■

Corn bran is themain by-product of the corn，which riches in nutritional value.As a high quality source of feed，corn bran can ease the shortage of feed resource and reduce the cost of feed industry.However the comprehensive utilization of the corn starch plant is completely inadequate，resulting in partof thewaste of resources.This paper aims to determinate the effective components of corn husk cellulose by the feed national standard method，and takingmaize peel as raw material，degrade corn husk cellulose material to make it fully into high value-added feed protein using Pichia pastoris 2.3250 fermentation method.The experimental results showed that the contents of cellulose and hemicellulose in corn bran were 16.40%and 47.68%respectively，and the protein contentwas 11.49%，the starch contentwas 15.50%，the fat content was 2.73%and the lignin contentwas 5.41%.When using the Pichia pastoris transformed corn skin components，in the absence of peptone added，culture for 48 h in the temperature was 25℃，microbial feed protein concentration is the highest，and the yeast cell number was 2.31×107/mL，the content of cellulose decreased from 16.40%to 6.22%，the hemicellulose contentdecreased from 47.68%to 33.45%.The study systematic analysis the important components of corn，and laid the foundation for the further research on the production ofhigh added value ofbacterial protein feed by using yeast fermentation.

corn bran；yeast；microbial protein feed

S816.4

A

1004-3314（2017）04-0031-03

国家自然科学基金项目（61361016）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（2013151412000）；内蒙古自治区草原英才工程项目；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划项目

*通讯作者

DO I：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170408