硫化氢通过p38MAPK和TGF-β1影响糖尿病小鼠心肌纤维化的研究*

丁利，宋冰，张浩强

（1.锦州医科大学研究生学院，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学附属第一医院 内分泌科，辽宁 锦州 121001）

硫化氢通过p38MAPK和TGF-β1影响糖尿病小鼠心肌纤维化的研究*

丁利1，宋冰2，张浩强1

（1.锦州医科大学研究生学院，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学附属第一医院 内分泌科，辽宁 锦州 121001）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.002

目的探讨硫化氢（H2S）对糖尿病小鼠心肌组织中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38M APK）、转化生长因子-β1（TG F-β1）及Ⅰ型胶原蛋白（C ol l agenⅠ）表达的影响，以及对糖尿病心肌纤维化的保护作用。方法18只雄性C 57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（N C组）、糖尿病对照组（ALX组）、H2S治疗组（ALX+H2S组），每组6只。采用四氧嘧啶（ALX）200 m g/kg腹腔注射复制糖尿病小鼠模型；模型复制成功后，N C组和ALX组每天自由饮用自来水；ALX+H2S组自由饮用浓度为90 μm ol/L的N aH S（H2S供体）溶液。8周后取材，监测空腹血糖、血脂；苏木精-伊红染色法观察心肌组织形态学变化；采用W es t ern bl ot检测p-p38M APK、TG F-β1及C oll agenⅠ蛋白表达；实时定量荧光聚合酶链反应检测p38M APK和TG F-β1m R N A的表达。结果与N C组比较，ALX组血糖、血脂升高（P＜0.05），心肌组织胶原表达量增加，心肌间质出现明显纤维化，p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白表达增高（P＜0.05），p38M APK和TG F-β1m R N A表达增加（P＜0.05）；糖尿病小鼠经H2S干预，血糖、血脂改善（P＜0.05），心肌间质胶原纤维明显减少，p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白表达下降（P＜0.05），p38M APK和TG F-β1m R N A表达减少（P＜0.05）。结论H2S可改善糖尿病小鼠血糖、血脂及心肌纤维化，可能与调节p38M APK和TG F-β1的表达有关。

硫化氢；糖尿病心肌纤维化；p38丝裂原活化蛋白激酶；转化生长因子-β1；Ⅰ型胶原蛋白

糖尿病预计在世界最常见死亡原因中排第5位[1]。糖尿病心肌病已成为糖尿病相关发病率和死亡率的一个主要原因[2]。转化生长因子-β1（Transf orm i ng growt h f act or-bet a1，TGF-β1）是一种由2条多肽链组成的生长因子，具有多种生物活性。有研究表明，TGF-β1的异常表达和活化可能参与糖尿病心肌病的发生和发展[3]。有证据表明，TGF-β1在心肌重塑过程中发挥重要作用，特别是在心肌纤维化中[4]。有研究显示，在糖尿病肾病中，活化的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-m i t ogen-act i vat ed prot ei n ki nase，p38M APK）可以进入到细胞核，调控下游代表性致纤维化因子——TGF-β1的表达及其生物效应[5]，最终促进细胞外基质过度沉积而形成肾纤维化[6]。硫化氢（hydrogen sul f i de，H2S）可以抑制TGF-β1信号[7]，且有证据表明，在各种纤维化相关疾病中，H2S具有保护和抗炎作用[8-10]。本实验欲通过观察糖尿病小鼠心肌中p38M APK和TGF-β1表达的变化，探讨H2S对糖尿病心肌纤维化，以及p38M APK和TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6J小鼠18只，3周龄，体重11～13 g，购于北京华阜康公司，实验动物质量许可证号：SCXX（京）[2009-0015]，动物饲养在温度（20～25℃）和湿度（50%～55%）恒定的环境中，12 h昼/夜循环照明（7∶00～19∶00）。定期消毒，可以自由获得水和食物。涉及动物的实验均按美国国立卫生研究院颁布的《实验动物的照料和使用指南》要求进行。

1.1.2 主要实验试剂 四氧嘧啶（Al l oxan，ALX）购于大连美仑科技公司，硫氢化钠（NaH S）（H2S供体）购于美国Si gm a公司，脱脂奶粉、TGF-β1和Col l agenⅠ兔抗小鼠抗体购于武汉博士德生物技术有限公司，p-p38M APK、β-act i n兔抗小鼠抗体、辣根过氧化物酶（horseradi sh peroxi dase，H RP）标记的山羊抗兔二抗均购于北京博奥森公司，细胞核/浆蛋白抽提试剂盒购于弗德生物科技有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，逆转录试剂盒购于日本TaKaRa公司，定量聚合酶链反应（pol ym erase chai n react i on，PCR）试剂盒购于韩国Bi oneer公司，实时PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 仪器与设备

雅培安妥超越血糖仪购于美国Abbot t公司，日立全自动化学分析仪购于北京泰林东方商贸有限公司，日立CF-16RXⅡ型高速冷冻离心机购于香港天美科技有限公司，徕卡手动石蜡切片机购于北京中仪光科技发展有限公司，酶标分析仪购于南京德铁实验设备有限公司，BG-power 600电泳仪电源购于北京百晶生物技术有限公司，增强化学发光（enhanced chem i l um i nescence，ECL）化学发光自动成像分析系统购于日本富士公司，组织匀浆机购于德国IKA公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quant i t at i ve real-t i m e pol ym erase chai n react i on，qRT-PCR）仪购于美国伯乐Bi o-rad公司；PCR扩增仪购于美国伯乐Bi o-rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及糖尿病模型的复制 动物适应性饲养1周，18只C57BL/6J小鼠随机分为3组（每组6只）：正常对照组（NC组）、糖尿病对照组（ALX组）、H2S治疗组（ALX+H2S组）。NC组予正常饮食，ALX组、ALX+H2S组予高脂饮食。8周后，ALX组、ALX+H2S组按体重（200 m g/kg）腹腔注射ALX复制模型，ALX分2次给药，第1次腹腔注射120 mg/kg，间隔24 h后再次腹腔注射80 m g/kg，为防止低血糖的发生，4.5～5.0 h后予以50%葡萄糖灌胃，注射药物72 h后于小鼠尾端断尾取血，用血糖仪检测小鼠禁食12 h的血糖浓度[11]，血糖浓度≥11.1 m m ol/L时判断模型复制成功。ALX+H2S组每天自由饮用浓度为90 μm ol/L的NaH S溶液[12]，换NaH S溶液1次/d；NC组和ALX组予以自来水。实验持续8周。

1.3.2 苏木精 -伊红染色法（hem at oxyl i n-eos i n s t ai ni ng，H E）染色观察心肌纤维组织学变化 取心肌组织，4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片后，以H E染色法染色，显微镜下观察摄像。

1.3.3 W es t ern bl ot检测p-p38M APK、TG F-β1及C ol l agenⅠ蛋白的表达 取各组小鼠左心室心肌组织，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（bi ci nchoni ni c aci d，BCA）比色法进行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶用于电泳分离蛋白，上样前蛋白样品95℃煮5 m i n，每孔组织蛋白上样量相等，置于电泳缓冲液中电泳，分离目的蛋白。将目的条带切下，60V湿转膜2 h，将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜。用三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（t ri s buf f ered sal i ne and t ween 20，TBST）配制的5%脱脂奶粉封闭2 h，封闭后用p-p38M APK、TGF-β1及Col l agenⅠ一抗（稀释比例为1∶100）37℃孵育1 h后4℃过夜。TBST洗膜3次，5 m i n/次，用H RP标记的山羊抗兔二抗（稀释比例为1∶2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，5 m i n/次。增强化学发光法（enhanced chem i l um inescence，ECL）显色，曝光后扫描，用Im age J图像分析软件进行光密度分析，以β-act i n为内参。

1.3.4 qR T-PC R 检 测 p38M APK 和 TG F-β1m R N A的表达水平 取各组左心室心肌组织，按照试剂盒说明书用RNAi so Pl us提取RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，含SYBR GreenⅠ的Accu PowerR2X Green Star qPCR M ast er M i x进行PCR反应（见表1）。逆转录反应条件：37℃预变性15 m i n，85℃变性5 s， 4℃退火。PCR反应条件：95℃预变性5 m i n，95℃变性5s，60℃退火30 s，65～90℃中每1℃都延伸1s，共45个循环。用熔解曲线来判断引物的特异性，用2-△△Ct法对组织p38M APK和NF-κBp65 m RNA水平进行相对定量分析。

表1 qRT-PCR引物

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较用单因素方差分析，检验方差齐性，两组间比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖、血脂比较

NC组、ALX组及ALX+H2S组空腹血糖（f ast i ng pl asm a gl ucose，FPG）、三酰甘油（Tri gl yceri des，TG）、总胆固醇（total chol est erol，TC）、低密度脂蛋白（l ow densi t y l i poprotei n，LDL）及高密度脂蛋白（hi gh densi t y l i poprot ei n，H DL）比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。ALX组与NC组FPG、TG、TC、LDL、H DL比较，经q检验，差异有统计学意义（q= -11.735、-14.703、-11.811、-12.347和10.883，P= 0.000），ALX组FPG、TG、TC、LDL升高，H DL降低。ALX+H2S组与ALX组FPG、TG、TC、LDL、H DL比较，经q检验，差异有统计学意义（q=11.025、13.019、11.703、9.562和-6.073，P=0.000），ALX+H2S组FPG、TG、TC、LDL降低，H DL升高。见表2。

表2 糖尿病小鼠的血糖、血脂变化 （n=6，m mol/L±s）

表2 糖尿病小鼠的血糖、血脂变化 （n=6，m mol/L±s）

注：1）与NC组比较，P＜0.05；2）与ALX组比较，P＜0.05

组别LDL NC组 9.71±0.13 0.46±0.08 2.65±0.08 1.32±0.05 1.50±0.09 ALX组 15.00±0.121） 1.10±0.081） 3.74±0.061） 1.02±0.041） 2.17±0.091）ALX+H2S组 10.03±0.102） 0.52±0.072） 2.66±0.062） 1.19±0.022） 1.65±0.062）F值 86.589 114.808 92.155 59.501 83.870 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000FPGTGTCH DL

2.2 各组糖尿病小鼠心肌病理形态学变化

ALX组与NC组比较，心肌细胞间隙增宽，心肌纤维排列明显紊乱，组织胶原表达量增加，心肌间质可见纤维化改变。ALX+H2S组与ALX组比较，细胞间隙变窄，心肌纤维排列较整齐，结构清晰，胶原表达量减少，间质有少量疏松结缔组织。见图1。

图1 各组小鼠心肌组织 （H E×200）

2.3 H2S对CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表达的影响

W est ern bl ot检测3组小鼠Col l agenⅠ、p-p38 M APK及TGF-β1蛋白表达，结果显示，各指标在3组中的表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。与NC组比较，ALX组小鼠心肌组织Col l agenⅠ、p-p38M APK及TGF-β1蛋白表达增加（q=-16.900、-8.788和-13.386，P=0.000）。ALX+H2S组与ALX组比较，小鼠心肌组织Col l agenⅠ、p-p38M APK及TGF-β1蛋白表达减少（q=15.721、12.467和11.354，P=0.000）。见表3和图2。

表3 糖尿病小鼠CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表达的变化 （n=6±s）

表3 糖尿病小鼠CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1蛋白表达的变化 （n=6±s）

注：1）与NC组比较，P＜0.05；2）与ALX组比较，P＜0.05

组别TGF-β1NC组 1.8347±0.1926 0.7184±0.0844 0.3541±0.0512 ALX组 3.7118±0.18891）1.1474±0.08571） 0.7521±0.05171）ALX+H2S组 1.9656±0.19222）0.5388±0.09162） 0.4145±0.05152）F值 178.042 82.063 104.073 P值 0.000 0.000 0.000Col l agenⅠp-p38M APK

图2 H2S对CollagenⅠ、p-p38MAPK及TGF-β1表达的影响

图3 p38MAPK mRNA的相对表达

2.4 H2S对各组小鼠心肌组织中p38MAPK和TGF-β1mRNA表达的影响

2.4.1 H2S对心肌组织中p38M APK m R N A表达的影响 qRT-PCR检测p38M APK m RNA的表达，结果显示，在各组p38M APK m RNA表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=14.981，P=0.005）。与NC组比较，ALX组小鼠心肌组织中p38M APK m RNA表达增加（q=4.404，P=0.005）；与ALX组比较，ALX+ H2S组小鼠心肌组织中p38M APK m RNA表达减少（q=-5.017，P=0.002）。结果提示H2S治疗抑制糖尿病小鼠心肌组织p38M APK m RNA的表达。见图3。

2.4.2 H2S对心肌组织中TG F-β1m R N A表达的影响 qRT-PCR检测TGF-β1m RNA的表达，结果显示，各组TGF-β1m RNA表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=26.550，P=0.001）。与NC组比较，ALX组小鼠心肌组织中TGF-β1m RNA表达增加（q=6.966，P=0.000）；与ALX组比较，ALX+H2S组小鼠心肌组织中TGF-β1m RNA表达减少（q= -5.336，P=0.002）。结果提示H2S治疗抑制糖尿病小鼠心肌组织TGF-β1m RNA表达。见图4。

图4 TGF-β1mRNA的相对表达

3 讨论

糖尿病心肌病是独立于冠状动脉疾病和高血压，与糖尿病相关的心脏结构和功能的相关改变[13-14]，心血管并发症被认为是糖尿病患者死亡的首要原因[15]，其中心肌纤维化是在许多不同的心脏疾病条件下发生的一种常见的病理过程，可以加重心肌僵硬，妨碍心室收缩和舒张功能，最终引发心力衰竭，甚至猝死[16-17]。有研究显示，氧化苦参碱通过影响TGF-β1/p38M APK信号转导通路的级联反应，减弱相关信号分子的表达，发挥抑制心肌纤维化作用[18]。TGF-β1是TGF-β超家族的主要亚型，在心脏中由心肌成纤维细胞、成肌纤维细胞和心肌细胞产生。TGF-β1异常增高在心肌纤维化的发生、发展中发挥重要作用[19]。TGF-β1可以刺激心肌成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原纤维及纤联蛋白合成增加，分解减少[3]。有研究报道，TGF-β1是胎鼠心肌成纤维细胞中胶原产生的强有效的刺激物，且由TGF-β1刺激产生的胶原产物在新生大鼠心肌成纤维细胞中大幅高于新生大鼠肺成纤维细胞[20]。

H2S是一种新型气体信号分子，一些研究发现，H2S在心血管疾病中发挥多种生物作用[21]，可以改善左心室功能，减轻心肌肥厚和心肌纤维化[14]。在本实验中，通过H E染色可观察到经H2S治疗的糖尿病小鼠，心肌间质纤维化明显减轻。研究发现，在链脲佐菌素处理的糖尿病大鼠中，血浆和心肌组织中H2S水平下降，且每天给予NaH S后可使H2S水平恢复正常[14]。有研究表明，在四氯化碳诱导的肝纤维化模型中，外源性H2S抑制TGF-β1表达，改善肝纤维化[22]。在输尿管梗阻引起的肾脏纤维化模型中，H2S的抗纤维化作用与TGF-β1信号通路下调有关，从而减少炎症反应和氧化应激[7]。

本研究显示，在糖尿病小鼠心肌中p38M APK和TGF-β1无论在m RNA水平，还是在蛋白水平都有所提高，经外源性H2S治疗后p38M APK、TGF-β1及Col l agenⅠ表达减少，胶原重塑得以改善，进而改善心肌纤维化。对于糖尿病引起的心肌纤维化，H2S可能是一种潜在的治疗方法。H2S对糖尿病模型的心肌损伤具有保护作用，并可抑制糖尿病模型的肾小管间质纤维化，但H2S是否与糖尿病心肌病中心肌纤维化的发病机制有关，以及其是否通过TGF-β1/p38 M APK信号转导通路影响糖尿病小鼠心肌纤维化，尚不十分清楚，具体机制有待进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Hydrogen sulfide influences myocardial fibrosis in diabetic mice by p38MAPK and TGF-β1*

Li Ding1,Bing Song2,Hao-qiang Zhang1
(1.Graduate School,Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121001,China; 2.Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121001,China)

ObjectiveTo study the effect of exogenous hydrogen sulfide (H2S)on the expressions of p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)and transforming growth factor-beta1 (TGF-β1)and on the protection of diabetic myocardial fibrosis.MethodsEighteen male adult C57BL/6J mice were randomly divided into normal control group(NC group),diabetes mellitus group(ALX group),and diabetes mellitus treated with H2S group(ALX+H2S group)with six mice in each group.The diabetic mouse model was established by intraperitoneal injection(i.p.)of 200 mg/kg ALX.The mice in the normal control and ALX groups drank tap water freely everyday.The mice of the ALX+H2S group freely drank NaHS (H2S donor)solution at a concentration of 90 μmol/L.After 8 weeks,fasting blood glucose and serum lipid were tested.The pathological changes of myocardial fibers were observed by HE staining.The expressions of p-p38MAPK,TGF-β1and collagenⅠwere detected using Western blot.The expressions of p38MAPK mRNA and TGF-β1mRNA were tested byqRT-PCR.ResultsCompared with the NC group,the fasting blood glucose and serum lipid increased (P＜0.05),the expression of collagen in myocardium increased and there was apparent myocardial interstitial fibrosis;the expressions of p-p38MAPK and TGF-β1proteins and collagenⅠ increased(P＜0.05),the mRNA expressions of p38MAPK and TGF-β1increased(P＜0.05)in the ALX group.After the intervention of H2S,the fasting blood glucose and serum lipid were improved(P＜0.05),the collagen fibers in the myocardial interstitium apparently decreased,the protein expressions of p-p38MAPK,TGF-β1and collagenⅠwere decreased(P＜0.05),the mRNA expressions of p38MAPK and TGF-β1were decreased (P＜0.05).ConclusionsH2S can ameliorate fasting blood glucose,serum lipid and myocardial fibrosis in diabetic mice,which might be related to the regulation of p38MAPK and TGF-β1expressions.

hydrogen sulfide;diabetic myocardial fibrosis;p38 mitogen-activated protein kinase;transforming growth factor-beta1;collagenⅠ

1005-8982（2017）03-0007-06

R 587.1

A

2016-08-01

辽宁省自然科学基金（No：201602308）；辽宁省博士启动课题（No：20131067）

宋冰，E-m ai l：songbi ng1978@163.com；Tel：0416-4673872