脂氧素受体激动剂BML-111对慢性神经病理性疼痛大鼠治疗的研究

陈永梅 彭春艳 龚兴瑞 秦成名

脂氧素受体激动剂BML-111对慢性神经病理性疼痛大鼠治疗的研究

陈永梅 彭春艳 龚兴瑞 秦成名⋆

目的 观察脂氧素受体激动剂BML-111对L5/6脊神经结扎术后大鼠的镇痛效果。方法 选择Wistar大鼠作为实验动物，建立L5/6脊神经结扎动物模型。观察鞘内给予不同剂量的BML-111对机械痛和热痛的抑制作用。鞘内给予100µg/kg BML-111并检测对患侧脊髓腰膨大部位IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影响。结果 BML-111剂量依赖性抑制对L5/6脊神经结扎所导致的神经病理性疼痛；其机械痛和热痛最大抑制率分别是67%和69%；半数有效量分别为16µg/kg和22µg/kg。鞘内给予100µg/kg BML-111可有效降低患侧脊髓腰膨大部位IL-1β，IL-6，TNF-α含量（P＜0.05）。结论 脂氧素受体激动剂BML-111可有效减轻L5/6脊神经结扎术后大鼠神经病理性疼痛，其机制可能与抑制脊髓背角炎症反应有关。

BML-111 L5/6脊神经结扎术 神经病理性疼痛 大鼠

慢性神经病理性疼痛是临床常见疾病，主要表现为局部疼痛过度敏感，包括机械性和热痛觉过敏，最终可导致抑郁，工作能力丧失等不良后果［1］。目前临床治疗主要采用阿片类药物及5羟色胺受体阻断剂和去甲肾上腺素再摄取抑制剂进行治疗，但效果并不满意［2］。而慢性神经病理性疼痛的主要机制是脊髓背角炎症反应，进而敏化神经元，因此抑制炎症反应对治疗慢性神经病理性疼痛具有重要意义［3］。在之前的研究中作者发现BML-111在体内具有重要的抗炎作用［4-5］。2015年4月至10月作者通过实验研究，观察脂氧素受体激动剂BML-111对慢性神经病理性疼痛大鼠的作用，并初步分析其可能机制。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择健康雄性Wistar大鼠，由湖北医药学院动物实验中心提供，试验时遵守NIH动物保护条例。所有大鼠自由进食水，光照和黑夜比为12h：12h（每天早晨8点开灯）。IL-1β，IL-6，TNF-α用ELISA 试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.2 实验方法 （1）实验分组与模型建立：将5mg氟哌利多与100ml水合氯醛混合，按照3ml/100g的剂量对大鼠行腹腔注射麻醉，动物麻醉后将其固定于手术台上，术中持续面罩给氧。按照文献介绍的方法建立脊神经结扎模型［6］，将大鼠背部毛发剃除后，喷洒酒精消毒，正中切开腰骶部皮肤，将PE10号管置入鞘内，从颈部皮肤穿出后固定于颈部，方便给药。分离椎旁筋膜，暴露椎板后将L5椎板下部剪除，可见L5脊神经位于偏内侧，从骶骨边缘处勾出L6脊神经，将L5、6脊神经结扎。缝合筋膜、皮肤，将大鼠放回笼中饲养。模型建立后2周将大鼠取出测量其基础阈值，患侧基础值＜10g且无对侧异常痛觉过敏现象。向大鼠鞘内注射2%利多卡因10μl，如大鼠未出现双后肢瘫痪，则排除。假手术组只切开皮肤，分离筋膜，暴露但不结扎神经。将符合条件的大鼠随机分入各实验组，每组各6只，分别鞘内给予生理盐水1、10、30、100、300μl/kg，观察其最大镇痛效果，并计算其疼痛最大抑制率。（2）行为学检测：机械痛测量时将动物放于网状支架上，长方形塑料盒内，适应15min后开始测量，将机械痛测量仪（IITC Life Science Inc，CA，USA）钝头以缓慢相同力量刺激患侧及健侧，如出现快速的缩足反应，则将当时显示器上的数值记录为缩足阈值，测量3次求其平均值。热痛测量时将大鼠放于透明玻璃上方的长方形塑料盒内，适应15min，将仪器发射的热光源分别照射大鼠双侧足底，记录出现缩足反射时的阈值，并测量3次求平均值。（3）IL-1β、IL-6、TNF-α含量的测定：将100μg/kg BML-111注射大鼠鞘内，并用15μl生理盐水冲洗，保证药物进入鞘内。2h后处死大鼠，将腰膨大部位的脊髓分离并取患侧，分离筋膜并用生理盐水冲洗干净，加入生理盐水磨碎，离心后取上清液，根据说明书用ELISA法测量肺组织匀浆IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3 统计学方法 采用GraphPad软件，统计方法选择单因素方差分析，最大抑制率（%，MPE）=（患侧最大值-患侧基础值）/（对侧值-患侧基础值），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

鞘内注射BML-111剂量依赖性抑制L5、6脊神经结扎术后神经病理性疼痛，药物达峰时间位于鞘内注射后约2h，注射8h后镇痛作用基本消除，BML-111对机械痛的最大抑制率为67%，半数有效量（ED50）为16μg/kg；对热痛的最大抑制率为69%，半数有效量（ED50）为22μg/kg。ELISA检测结果发现相比假手术组，脊神经结扎增加IL-1β、IL-6、TNF-α的表达（P＜0.05），而给予BML-111可有效降低其含量（P＜0.05），而给予生理盐水不影响IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。见图1-2。

图1 BML-111剂量依赖性抑制脊神经结扎后大鼠的机械痛（A）和热痛（B），及机械痛（C）和热痛（D）量效曲线

图2 鞘内注射100μg/kg BML-111后2h脊髓患侧IL-1β（A），IL-6（B），TNF-α（C）表达情况。（A、B分别表示与假手术组和脊神经结扎组比较：P＜0.05）

3 讨论

慢性神经病理性疼痛是一种脊髓慢性炎症性疾病，其脊髓背角炎症因子升高可敏化脊髓神经元导致痛觉过敏，从而导致慢性疼痛。其炎症因子来源主要为脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞，其被激活后释放一系列炎症因子。本资料结果显示，与假手术组比较，脊神经结扎后IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义，表明神经病理性疼痛大鼠患侧脊髓背角存在明显的炎症反应。

脂氧素是重要的促进炎症消退的物质，减少炎症介质的局部浓度。在本实验中发现鞘内给予BML-111剂量依赖性抑制由脊神经结扎所诱发的神经病理性疼痛，其效果确切，最大疼痛抑制率达70%左右。鞘内注射后可有效降低同侧IL-1β，IL-6，TNF-α的含量，因此作者推测其镇痛作用主要与抑制炎症反应，降低炎症因子含量有关。在以往的试验中也发现激活脂氧素受体可有效抑制IL-6，TNF-α炎症因子的分泌，且可增加体内IL-10的含量，从而发挥其抗炎效果［7-9］。且最近一篇报道显示鞘内直接脂氧素A4注射也发现有明显的抑制疼痛作用，且其镇痛机制与抑制TNF-α释放有关［10］。由于慢性神经病理性疼痛中炎症因子的产生主要是小胶质细胞和星形胶质细胞［11］，因此BML-111可能主要作用于小胶质细胞和星形胶质细胞［12］。其作用机制可能抑制与PI3-K、p38和p42/44 MAPK、NF-kB和AP-1信号转导途径有关［13］。但由于脂氧素半衰期较短，因此实验中采用脂氧素受体激动剂BML-111鞘注射，产生明显抑制炎症因子释放的作用，产生效果类似。

神经病理性疼痛产生后，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高，其主要来自于神经系统的胶质细胞，因此在实验中被用作慢性神经病理性疼痛产生后脊髓炎症因子的标志［14］。慢性神经病理性疼痛传统仍较多使用阿片类药物治疗，但容易产生耐受，呼吸抑制等问题，且长期使用后可导致疼痛敏感化，因此临床疗效受到质疑［15］。在本资料中，根据慢性神经病理性主要是病理特征炎症导致的疼痛敏化，采用促进自身机体炎症反应消退的方法抑制神经病理性疼痛，这种方法具有较好的应用前景，且克服阿片类药物的副作用。

总之采用BML-111鞘内单次注射可有效抑制神经病理性疼痛，成本较低，成功率高，具有较好的应用前景。作者将进一步明确BML-111作用于胶质细胞信号通路，进而为临床使用此药物治疗神经病理性疼痛提供参考。

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Objective To test the effect of BML-111 on neuropathic pain induced by L5/6 spinal nerve ligation. Methods Wistar rats were used for establishment of rats L5/6 spinal nerve ligation model. Mechanical paw withdrawal threshold and thermal paw withdrawal threshold were measured after intrathecal injection of different dose BML-111. Two hours after the intrathecal injection of 100ug/kg BML-111，the rats ipsilateral spinal cord lumbar enlargement were acquired and measured for IL-1β，IL-6，TNF-α. Results BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior with maximum possible effect（67%）and ED50（16µg/kg）for mechanical stimulation；69% and 22µg/kg for thermal stimulation. 100µg/ kg BML-111 reduced IL-1β，IL-6，TNF-α concentration in ipsilateral spinal cord（P＜0.05）. Conclusions BML-111 dose dependently suppressed neuropathic pain behavior，the reason may be attribute to the reduction of the infl ammatory mediators production.

BML-111 L5/6 spinal nerve ligation Neuropathic pain Rats

湖北省十堰市科技局指导项目（ZD20111016）

442000 湖北省十堰市太和医院

*通信作者