单糖甲基化GC/MS片段定性分析方法

廖洪梅

在对多糖样品进行结构分析时，甲基化方法是一种常用的、非常重要的方法，它可以提供单糖组成和链接方式等信息。通常情况下，会利用质谱分析手段对甲基化衍生物进行研究，而气相质谱（GC/MS）由于价格相对低廉和完备的数据库较其他形式的质谱在这方面得到了更广泛的应用。多糖样品经过甲基化、乙酰化和水解后，在离子源的裂解效应下会产生诸多的离子片段（或称碎片离子），根据这些离子片段的质核比和丰度等信息可以对多糖的连接单元进行定性分析，为分析多糖的一级结构提供重要的信息[1]。

构成多糖的单糖残基较常见的有六碳糖、五碳糖、脱氧六碳糖等。由于不少单糖残基互为同分异构体，在甲基化和乙酰化处理后，衍生物裂解产生的离子片段极为相似；即便是在单糖残基不为同分异构体的情况下也存在裂解片段相互匹配度较高的情况。这些情况对定性工作造成了很大的干扰，因此仅依靠数据库自动检索的定性信息已经不能满足对多糖中单糖残基定性分析的需要，应依据理论和经验补充定性方法以提高未知物与目标物比对的准确度。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

气质联用仪（GC/MS），电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 35～500。配有NIST或WILLY谱库。

1.2 试验条件和方法

纯化的多糖样品经甲基化完全后，水解并乙酰化；此衍生化样品即可进行GC/MS分析。具体的试验条件（如采用的甲基化、乙酰化方法）及气相色谱条件的设定等可根据试验要求、试验效果自行选择、确定，试验方法的不同对最终定性分析不产生影响[2]，但是要严格控制甲基化、乙酰化反应不完全产生的副产物对试验的干扰。

2 结果与讨论

2.1 裂解原理分析

多糖样品中的单糖残基一般要在分析前转化成为部分甲基化乙酰化产物，在转化过程中自由羟基被甲基化形成甲氧基，非自由羟基则被乙酰化。

甲氧基分子中的氧原子由于相连甲基的推电子效应，非常容易失去电子，在离子源射出的高能电子的攻击下会失去一个电子，衍生化单糖分子成为奇电子离子，失去一个电子的氧原子则成为游离基中心或电荷中心。下面单糖甲基化产物的裂解过程以非还原末端葡萄糖 Glc（1→）甲基化产物为例阐述。

2.1.1 游离基中心诱导的α断裂

如图1所示，在C3位的甲氧基游离基中心的诱导下，C2与C3之间的键断裂，一个电子转移与游离基中心未成对的电子配对，形成新键，并随之产生一个较稳定的偶电子碎片离子m/z 205。同样的反应原理，C2或C4位甲氧基的氧原子也可以诱发α断裂，分别形成较稳定的偶电子碎片离子m/z 118（注：C1位以氘标记）和 m/z161（见图 2）。m/z 118，m/z 161和m/z 205被称为母碎片离子，它们反映了分子的裂解途径。

图1 α断裂产生m/z 205，m/z 118示意图

有些母碎片离子会进一步发生消除反应（elimination reaction ，re），产生次级碎片离子和稳定的中性分子；次级碎片离子可以再发生一次消除反应生成三级离子和中性分子。新生成的离子比其前体离子稳定，促进了反应的进行。图2中偶电子碎片离子m/z 161可以通过丢失一个甲醇生成m/z 129离子，也可以通过丢失一个乙酸分子产生m/z 101离子。同样，m/z 205离子可以丢失一个乙酸分子产生m/z145离子。m/z 129可进一步产生m/z 87离子和乙烯酮分子，m/z 101可消除一分子的甲醛产生三级离子 m/z 71，m/z145离子在失去一分子甲醇后会形成 m/z 113离子碎片，由于m/z 113片段的产生会导致过多的双键，所以丰度一般很小。

图2 α断裂及消除反应示意图

2.1.2 电荷中心诱导的i断裂

如下图3所示，在C2位甲氧基中氧原子所带正电荷的诱导下，一对电子完全被正电荷所吸引，造成C2、C3之间的键断裂和电荷的转移，并随之产生一个较稳定的偶电子碎片离子m/z 205；若i断裂由C4位的甲氧基诱导，则会产生m/z 162离子（注：C1位以氘标记），断裂之后都会随之产生一个正电荷从碳原子转移到氧原子的过程，这种形式的离子会更稳定。在正电荷转移后，母片段离子会发生消除反应继而产生次级离子 m/z 102、m/z 145。三级碎片离子的产生途径与α断裂的相同。若i断裂由C3位的甲氧基诱导，则会产生m/z 118离子。

图3 i断裂及消除反应示意图

2.1.3 α断裂与i断裂的竞争

对于奇电子离子形式的衍生化单糖分子来说，α断裂要比电荷诱导的i断裂有更大的竞争优势，反映到质谱图中则是α断裂产生的离子片段具有更大的丰度。如在衍生化Glc（1→3）分子中，同样是C4位甲氧基诱导的断裂，α断裂产生的母离子m/z161及次级离子m/z 101、m/z 129的丰度就明显大于i断裂产生的m/z 189离子的丰度。因此在分析甲基化单糖分子的裂解片段时，主要考虑α断裂途径下产生的母离子片段及其次级、三级离子片段。

2.1.4 其他途径

除了α断裂与i断裂外，甲基化单糖分子还可能通过一些次要的反应途径裂解，其中比较常见的是氢重排反应和消除反应（奇电子离子分子产生奇电子母片段离子）。正是由于裂解过程中反应机理的复杂性和反应途径的随机性，导致了同一分子的GC/MS离子片段谱图之间具有一定的差异性，对物质的定性产生了干扰。

2.2 不同连接方式糖残基的主要裂解片段[4]

多糖分子中常见中性单糖残基有五碳糖、六碳糖、脱氧六碳糖等类别，每类糖残基都由若干同分异构体组成，虽然它们的构象不同，但是在甲基化和乙酰化后产生的裂解片段却基本相同，故表1-3中仅以不同的链接方式区分并按照离子片段的性质进行了分类总结。

2.2.1 甲基化六碳糖的主要裂解片段

在多糖分子中，主要存在三种六碳糖：葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和甘露糖（Man），表1对甲基化六碳糖在不同连接方式下通过主要裂解途径产生的离子片段进行了归纳总结。

2.2.2 甲基化五碳糖残基的主要裂解片段

在多糖分子中，存在三种主要的五碳糖：阿拉伯糖（Ara）、核糖（Rib）和木糖（Xyl），这Ara和Xyl在多糖分子中常以呋喃式或吡喃式两种形式存在，Rib主要以呋喃形式存在。表2对甲基化五碳糖在不同连接方式下通过主要裂解途径产生的离子片段进行了归纳总结：

表1 甲基化六碳糖的主要裂解片

表2 甲基化化五碳糖的主要裂解片段

2.2.2 甲基化脱氧六碳糖残基的主要裂解片段

在多糖分子中常见的脱氧糖为六碳脱氧糖，主要为鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc），表3对甲基化脱氧六碳糖在不同连接方式下通过主要裂解途径产生的离子片段进行了归纳总结。

表3 甲基化Rha和Fuc的主要裂解片段

2.3 不同类型离子片段应采用的比对方法

通常情况下，GC/MS分析产生的结果可以通过配套工作站中的数据库进行自动比对，比对结果是通过未知物与目标物离子片段的丰度和质核比的匹配程度形成的。这种方法在简单有机物的分析上准确度比较高，而在分析多糖各组分单糖的甲基化衍生物时却出现了较大的偏差，如果仅依据数据库自动比对的结果进行定性分析，甚至会产生错误的结论。在利用甲基化单糖裂解后形成的多种离子片段进行定性分析时，应根据碎片离子不同的类型采用不同的比对方法，有些片段要重点考虑丰度的匹配度，而有些则只需考虑质核比的匹配度，有些则需要两者综合评价。

2.3.1 母碎片离子

母碎片离子是分子第一次断裂产生的，它们显示了分子裂解的重要信息，由于母片段大多还会进一步的裂解形成二级片段甚至更高级别的片段，所以除了 m/z87，m/z117等这些不再裂解的母片段外，丰度的大小往往会由于仪器或实验条件的变化而有所不同，故丰度的匹配度可以不加考虑；相反，母片段的质核比的匹配度却很重要。由于母片段的产生反映了分子的裂解方式，母片段不同则表明未知物与目标物的裂解方式不同，即未知物与目标物非同一分子，一定要 100%匹配，才能对未知物进行初步认定。应当特别注意的是，有些母片段离子的丰度较低，如m/z233、m/z261等，在进行未知物与目标物的比对时容易被忽略而造成误判。

2.3.2 次级碎片离子

母碎片离子会按照比较固定的几种模式进一步裂解，形成次级碎片离子以及更高级片段，优势裂解途径产生的次级片段将有较高的丰度，若次级片段质核比相同但丰度差别较大则意味着是由不同的裂解途径产生的。因此在比对这类片段时，要在质核比匹配的前提下考虑丰度的匹配度。如m/z129是很多单糖衍生物裂解后都会产生的次级片段，但是在有的产物片段中丰度很高如 Glc（1→）中，在有的产物片段如Glc（1→4）中丰度则不大，所以在做比对时应区别对待，不能只考虑质核比的匹配程度。

2.3.3 高级碎片离子

高级碎片离子是指次级裂解片段进一步裂解产生的三级或三级以上裂解片段，这些片段的质核比大多不大，在对比中的作用主要是对推导的裂解方式进行验证。由于离子片段在裂解过程中会有多种裂解途径并会受到偶然因素的影响，所以不同的实验条件下产生的高级裂解片段往往会在质核比和丰度上有所差异，比对这类片段时，在丰度和质核比的匹配度上都可不做太高要求，只要主要的、丰度较高的高级碎片离子能够匹配即可认定（详见表 1-3），没有必要要求未知物和目标物的每个高级片段都有对应。

2.3.4 特征碎片离子（特征片段）

某些一级裂解片段（母碎片离子）的作用比较特殊，可以看作某类单糖甲基化衍生物的标志性片段，它们对未知物的正确定性有着极为重要的指示作用；特征母碎片离子裂解产生的典型的次级裂解片段，利用它们与母特征片段的相互印证关系可以提高判断的准确性，所以依然具有标志性意义，故在表中也进行了标记（详见表1～3中以星号标记的离子片段）。

特征片段对正确定性的意义可以通过下面的例子说明：非还原末端Ara和Glc产生的裂解片段中有90%以上的片段无论是在质核比还是在丰度上都非常相似，在数据库中相互的匹配度很高，区别是非还原末端 Glc的裂解片段中具有特征片段m/z205，而非还原末端Ara的裂解片段中则不含有此片段。如果在比对中忽略了特征离子片段进行定性，将会造成极大的困扰，甚至误判。

3 结论

在利用 GC/MS对多糖链接方式及链接单元进行分析时，可利用保留时间和随机数据库对未知物拟对应的目标物进行初步筛选。将匹配度较高的数个疑似目标物的离子片段分类，将其特征片段与未知物的片段质核比进行比对，若未知物裂解片段中含有某一目标物所有的特征片段，则可进行下一轮比对；若不能完全匹配，则说明未知物与目标物无对应关系。将特征片段匹配的疑似目标物的母碎片离子与未知物的离子片段的质核比进行比对，完全匹配者再比对它们之间次级碎片离子的质核比及丰度的匹配度。经过这样三步筛选后，符合度最高的则为未知物应该对应的目标物。

当然，GC/MS不是多糖结构分析的唯一手段，对多糖链接单元分析的最终结果还应综合考虑组分分析、红外光谱分析、核磁共振分析等分析手段的结果并进行适当的修正，以提高判定的准确性。

[1] 周鹏,谢明勇,聂少平.茶多糖 TGC结构特征 [J].中国科学(C辑:生命科学),2004,34（2）:178-185.

[2] 张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社,1997:11-198.