油茶炭疽病拮抗放线菌CF17发酵液的抑菌活性及活性成分的分离纯化

2017-03-07 11:31刘君昂周国英何苑暤
关键词:放线菌炭疽病发酵液

邓 雷, 刘君昂, 周国英, 张 娜, 何苑暤

(中南林业科技大学,森林有害生物防控湖南省重点实验室/经济林培育与保护教育部重点实验室,湖南 长沙 410004)

油茶炭疽病拮抗放线菌CF17发酵液的抑菌活性及活性成分的分离纯化

邓 雷, 刘君昂, 周国英, 张 娜, 何苑暤

(中南林业科技大学,森林有害生物防控湖南省重点实验室/经济林培育与保护教育部重点实验室,湖南 长沙 410004)

采用十字交叉法测定CF17发酵液的抑菌谱,并通过离心、旋转蒸发浓缩、丙酮沉淀、固相萃取以及半制备高效液相色谱法对抑菌物质进行分离纯化和鉴定.结果表明,CF17发酵液对油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶软腐病、杉木炭疽病、核桃壳梭孢、降香黄檀炭疽病、檀香炭疽病等的病原菌均有抑菌效果.50%丙酮分离纯化效果优于乙醇沉淀法与乙酸乙酯沉淀法;在固相萃取中,活性物质主要集中在60%乙腈梯度洗柱样品中,最后经HPLC分离收集到一个有明显抑菌圈的样品.经质谱鉴定抑菌成分为Tetramycin A.

油茶炭疽病菌; 拮抗放线菌; 抑菌活性; 分离纯化

油茶(CamelliaoleiferaAbel)是我国特有的木本油料树种,具有极高的经济价值[1].但油茶主要病害如油茶炭疽病、软腐病、叶枯病、根腐病等会危害油茶果、叶、枝梢和花蕾等主要部位,引起严重的落果、落叶、落蕾、枝梢枯死等现象,甚至造成整棵植株死亡,致使油茶减产20%~40%,严重影响油茶产量和茶油品质,经济损失巨大[2-5].目前,施用化学药剂为防治油茶病虫害的常用方法,但因化学药物残留及病虫害抗药性等问题的出现,使得生物防治方法成为当前热点.

放线菌是微生物中重要的类群,其代谢产物是抗生素的重要来源[6-7].根据化学组成的不同,其抗生素可以分为4种:氨基糖苷类抗生素,如常用的井冈霉素、中生菌素、春雷霉素等[8];核苷类抗生素,如农抗120、尼可霉素、庆丰霉素等[9];大环内酯类抗生素及四环素类抗生素,其中大环内酯类抗生素因其低毒、不易产生抗药性等特点,在医学、食品及农业领域中广泛应用,如红霉素[10]、纳他霉素[11]、梧宁霉素[12].本实验室通过对油茶根际土壤进行分离、筛选,得到一株对油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)有较强抑制作用的放线菌,经过形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为小白链霉菌(Streptomycesalbulus),并命名为放线菌CF17.通过前期理化性质及发酵条件优化等试验发现,该菌对真菌性病原菌有很强的抑制和杀灭作用,且理化性质十分稳定,具有开发成生物农药的潜力.为此,本试验对油茶炭疽病拮抗菌CF17发酵液的抑菌谱进行测定并分离纯化其抑菌活性物质,为其生物农药开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 拮抗放线菌 小白链霉菌CF17,由中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室森林微生物菌种保藏中心分离并保存.

1.1.2 供试病原菌 油茶炭疽病病原菌、油茶叶枯病病原菌(Pestalotiopsismicrospora)、油茶软腐病病原菌(Pathogencamellia)、杉木炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)、核桃壳梭孢病原菌(Fusicoccumjuglandinum)、降香黄檀炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)、檀香炭疽病病原菌(Colletotrichumfructicola)均由中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室森林微生物菌种保藏中心提供.

1.1.3 供试培养基 PDA培养基(活化培养基):用于放线菌CF17、供试病原菌活化及抑菌活性测定.

高氏一号培养基:用于放线菌CF17液体培养.

发酵培养基:葡萄糖15 g,大豆粉15 g,NaCl 2.5 g,CaCO32 g,蒸馏水1000 mL,pH自然.

1.1.4 主要仪器 美国热电DNA120型核酸干燥系统,恒温振荡培养箱,日本岛津LC-10A型制备型高效液相色谱仪,美国热电LTQ velospro型液相色谱—质谱联用仪,日立高速冷却离心机,202-3AB型电热恒温干燥箱.SPE固相萃取柱:Waters Sep-Pak Vac 6cc C18-1 g;反相C18色谱柱:XBridge TM Prep C18 5 μm(10 mm×250 mm).

1.2 方法

1.2.1 放线菌CF17发酵液制备 将试管中保藏的放线菌CF17转接于PDA固体培养基上进行活化,用打孔器将活化好的CF17菌落打成菌饼,并接入液体高氏一号培养基中,30 ℃下培养4 d得到CF17种子液,再按5%的比例接入装有液体发酵培养基的三角瓶中,30 ℃、180 r·min-1条件下培养7 d得到发酵液.发酵液在10 000 r·min-1、4 ℃条件下离心30 min,得到无菌发酵上清液和菌体沉淀.

1.2.2 CF17发酵液抑菌活性测定 将试管保藏的7种供试病原菌进行活化,并用0.6 cm打孔器将各病原菌菌落打成0.6 cm菌块.无菌条件下,吸取100 μL发酵液加入PDA平板中,刮铲涂匀,在平板正中央接入各待测病原菌菌块,并以加100 μL无菌发酵液体培养基为对照,30 ℃下培养5 d,通过菌丝生长速率法[13]测定菌丝生长抑制率.每个处理重复3次.

1.2.3 各待测样品抑菌效果测定 用打孔器将活化好的油茶炭疽病病原菌打成0.6 cm菌饼,在无菌条件下将菌饼接入装有100 mL PDA液体培养基的500 mL三角瓶中,28 ℃、160 r·min-1条件下恒温振荡培养2 d,即成油茶炭疽病病原菌种子液;再按5%的比例加入装有100 mL PDA液体培养基的500 mL三角瓶中,同等条件下培养制得油茶炭疽病病原菌发酵液.向灭菌培养皿中加1 mL油茶炭疽病病原菌发酵液,与10 mL 30~40 ℃的PDA培养基充分混合,制成油茶炭疽病病原菌PDA混合平板,静置冷却使之凝固.用0.6 cm打孔器对混合平板打孔,吸取各待测样品30 μL,加入混合平板的孔中,以加等量CF17无菌发酵液为对照,28 ℃下培养3 d,用十字交叉法[14]测量抑菌圈直径大小,每次试验设置3个重复.此方法适用于萃取剂及其浓度筛选及SPE纯化中收集到的各样品的抑菌试验.

1.2.4 萃取剂的筛选 无菌发酵上清液经过旋转蒸发浓缩,得到抑菌物质初提物.取3份等量无菌发酵上清液,每份加入等量乙醇、乙醇乙酯、丙酮萃取初提物,充分混匀,4 ℃下静置过夜.分别收集两相分离的物质,旋转蒸发去除萃取溶剂,并分别对得到的两相物质进行抑菌试验,根据抑菌圈大小确定最佳萃取剂.

1.2.5 萃取剂浓度的筛选 依次选用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的最佳萃取剂萃取初提物,4 ℃下静置过夜,10 000 r·min-1条件下离心30 min,弃沉淀,留上清.上清经旋转蒸发去除萃取溶剂,以CF17发酵液为对照,通过抑菌试验确定最佳萃取剂的最佳浓度.

1.2.6 SPE纯化初提物 通过C18固相萃取柱萃取分离经萃取剂初步分离纯化后的CF17抑菌物质,收集未被吸附的样品,分别用0%、10%、60%、100%的乙腈进行洗脱,收集洗脱组分,再经旋转蒸发去除各组分中的乙腈,以CF17发酵液为对照,对各组分进行抑菌试验.根据抑菌圈大小确定抑菌活性强的组分.对抑菌强的组分进行浓缩干燥,保存于冰箱中备用.

1.2.7 HPLC纯化CF17抑菌物质 用乙腈溶解活性最强组分并过0.45 μm滤膜,以进样量40 μL,流动相含0.1% TFA的乙腈A和超纯水B进行梯度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长260 nm,用PE管收集各色谱峰组分.对收集的每个组分进行干燥浓缩,并对各组分进行积分处理使其浓度一致,测定各组分的抑菌活性.

1.2.8 主要抑菌物质结构鉴定 采用美国热电LCQ-MS联用仪对主要抑菌组分进行质谱扫描,鉴定CF17主要抑菌物质结构.

1.2.9 数据处理 采用SPASS 19.0与Excel对试验数据进行分析.

2 结果与分析

2.1 CF17发酵液的抑菌活性

结果(表1)表明,CF17发酵液对油茶叶枯病病原菌的抑制效果最好,抑菌率达到98.15%;对油茶、杉木、檀香、降香黄檀炭疽病病原菌均有较好的抑制效果,抑菌率都在90%以上(图1);对油茶软腐病病原菌的抑制效果最差,抑菌率为51.48%.因此,放线菌CF17主要分泌抗真菌类的抗生素.

表1 CF17发酵液的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of actinomycete CF17 fermentation broth

图1 CF17发酵液对油茶叶枯病病原菌(左)和油茶炭疽病病原菌(右)的抑制效果
Fig.1 Antifungal effect of actinomycete CF17 fermentation broth onP.microspora(left) andC.gloeosporioides(right)

2.2 萃取剂对CF17发酵液抑菌活性的影响

试验表明,丙酮、乙醇、乙酸乙酯有机相均有抑菌效果,水相中,仅乙酸乙酯萃取的物质有活性.由此可知,该活性物质易溶于丙酮和乙醇,微溶于乙酸乙酯.通过抑菌圈直径大小判定,用丙酮作为萃取剂所产生的抑菌活性最大(表2).因此,选用丙酮作为萃取剂.

表2 萃取剂对CF17抑菌活性的影响1)Table 2 Effects of different precipitation methods on the antifungal activity of CF17 fermentation broth

1)数据采用LSD法进行多重比较分析,同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05),“-”为无抑菌效果.

2.3 丙酮浓度对抑菌活性的影响

结果表明,选用50%丙酮作为萃取剂所产生的抑菌效果最好,与阳性对照组(CF17无菌发酵液)的抑菌效果相差不大(图2),并与其他浓度的活性存在明显差异.因此,选用50%作为丙酮浓度.

2.4 SPE对抑菌初提物的纯化效果

如图3所示,用0%(1号组分)、10%(2号组分)、100%(4号组分)乙腈洗脱下来的各组分均没有抑菌活性;只有60%(3号组分)乙腈洗脱组有抑菌效果,且与对照组抑菌圈大小相差不大,得到的抑菌组分为粽色黏稠状物体.因此,用固相萃取方法能有效减少抑菌初提物中的杂质,且抑菌活性物质存在于60%乙腈洗脱液中.

图2 丙酮提取物抑菌活性差异性分析Fig.2 Differential analysis of antifungal activity of acetone extract

2.5 HPLC对抑菌物质的纯化效果

根据HPLC色谱分析图(图4),收集每个色谱峰流出的组分共23个.对这23个组分进行的抑菌试验(图5)表明,第15个组分(即27.21 min处收集的组分)能产生明显的抑菌圈,其他组分均无抑菌效果.因此,确定27.21 min处收集的色谱峰组分是CF17的主要抑菌物质,得到CF17抑菌纯化物.

图4 HPLC对CF17抑菌物质的纯化Fig.4 Antifungal substances purified by HPLC

图5 HPLC分离得到的23个色谱峰组分的抑菌效果
Fig.5 Antifungal effect of 23 chromatographic peaks separated by HPLC

2.6 CF17主要抑菌物质的结构鉴定

图6 Tetramycin A化学结构式Fig.6 Chemical structure of Tetramycin A

通过液质联用,对27.21 min处的物质进行质谱扫描,检测到[M+H]+为696,[M+Na]+为718,初步确定该物质是分子质量为695的一种抗生素.根据相关文献,推断其为Tetramycin A,其分子式为C35H53NO13,结构式见图6.

3 讨论

放线菌CF17对真菌类病原菌有很强的抑制效果,其中对油茶叶枯病病原菌和炭疽属病原菌的抑菌率达到90%以上.该菌产生的活性物质易溶于丙酮和乙醇,用50%丙酮沉淀和固相萃取等方法能有效减少抑菌物质中的大量杂质和粽色色素.对经HPLC分离得到的抑菌活性物质进行质谱鉴定,确定其为Tetramycin A,为一种大环内酯类抗生素.

Tetramycin包含Tetramycin A和Tetramycin B 2种同系物,为梧宁霉素的重要组成部分,具有毒性低、用量少、效果明显、无副作用等特点,能有效防治粮食和饲料中的霉菌[15],并能用于植物真菌病害的防治,且能促进植株根系生长[16-17].钟丽绢等[18]研究发现,Tetramycin不仅能够防治水稻稻瘟病,而且能提高水稻叶片内苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等相关防御酶的活性,从而提高水稻抗病性.贾树国等[19]用梧宁霉素防治梨树白粉病,800倍液连续喷洒2~3次能达到很好的防治效果,且能促进梨树组织愈合、弱苗根系生长、老化根系复苏,提高梨树的抗病能力及优化梨果品质.

试验过程中发现,放线菌CF17分泌的抑菌活性物质对紫外线很敏感,紫外光照射后,其抑菌率在10%以下;同时发现,该菌株产生的抑菌活性物质对某些病原性细菌也有抑制效果,下一步将对此进行研究.拮抗菌CF17具有遗传稳定、抗菌谱广等特点,其产生的活性物质对油茶常见病害有较好的抑制效果,因此可以通过林间试验进一步验证其抑菌效果,更好地为其推广应用提供理论基础.

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(责任编辑:杨郁霞)

Antifungal activity of broth ofCamelliaanthracnose of antagonistic actinomycete CF17 and isolation and purification of its antifungal substances

DENG Lei, LIU Jun′ang, ZHOU Guoying, ZHANG Na, HE Yuanhao

(Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests/Key Laboratory of Education for Non-timber Product Forest Silviculture and Protection, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, Hunan 410004, China)

The antibacterial spectrum of actinomycete CF17 fermentation broth was determined, and the antifungal substances were separated and purified by centrifugation, rotary evaporation, acetone precipitation, solid phase extraction and semi liquid chromatography. The results showed that CF17 fermentation broth of fungal pathogens had antifungal effect onColletotrichumgloeosporioides,Pestalotiopsismicrospora,Pathogencamellia,Colletotrichumgloeosporioides,Fusicoccumjuglandinum,Colletotrichumgloeosporioides,Colletotrichumfructicola. 50% acetone separation purification was superior to ethanol precipitation and ethyl acetate precipitation. In terms of solid phase extraction, active substances mainly concentrated in 60% acetonitrile gradient washing column sample. Lastly, a sample with obvious bacteriostatic ring was collected by HPLC points, whose antifungal ingredient was identified as Tetramycin A by mass spectrometric identification.

Colletotrichumgloeosporioides; antagonistic actinomycete; antifungal activity; isolation and purification

2016-03-07

2016-04-22

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD19B0803);中南林业科技大学研究生创新资助项目(CX2014B23).

邓雷(1986-),男,硕士研究生.研究方向:森林微生物应用.Email:284024427@qq.com .通讯作者刘君昂(1963-),男,教授,博士生导师.研究方向:森林健康经营技术.Email:kjc9620@163.com.

S182; S763

A

1671-5470(2017)01-0015-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.003

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