C-ROSE技术在诊断性介入呼吸病学中的应用

王伟 综述 于力克 徐春华 审校

·综述·

C-ROSE技术在诊断性介入呼吸病学中的应用

王伟 综述 于力克 徐春华 审校

近年来超声支气管镜、针吸细胞学检查(fine-needle aspiration, FNA)，超声内镜下经支气管镜针吸活检(endobronchial ultrasound- guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA)，电磁导航，超细支气管镜等诊断性介入技术的迅速发展，大大拓展了内镜医师的工作视野，提高了肺脏、纵隔、胸膜等常规支气管镜下不可视病灶、尤其恶性肿瘤标本取材的成功率，使得诊断性介入技术发展到了新的高度和广度，其发展在很大程度上代表了一个呼吸专科临床诊治水平的高低[1]。然而，任何标本取材过程对患者都存在创伤风险，如何判断标本的充足度和有效性避免不必要的取材。如何给介入医师以合理、准确的现场反馈？如何在有效取材和规避风险之间寻求最佳平衡？这些是每位呼吸介入医师工作中始终需要面对的实际问题[2]。快速阅现场评估(rapid on-site evaluation，ROSE)是一种在穿刺、活检、刷片等方法收集标本时,相关人员在场，对所得标本满意度进行快速评价、得出初步诊断和优先策略，反馈指导下一步操作的技术。ROSE分为现场细胞学评估(cytological rapid so-site evaluation，C-ROSE)和现场微生物学评估(microbiological rapid so-site evaluation M-ROSE)，本文拟就C-ROSE在诊断性介入呼吸病学中的应用现状和进展做一综述，意在引起更多同道的关注和思考。

C-ROSE 技术的概念、起源

C-ROSE是一种伴随于诊断性介入呼吸病学操作的“极速细胞学判读技术”，其判读内容包括：细胞形态、分类、计数、构成比、排列、相互关系、背景及外来物分析。国外有关C-ROSE技术最早的系统研究分析是Austin 和Cohen在1993年对接受CT 引导下经皮肺针吸活检(CT-guide percutaneous fine-needle aspiration，CT-PFNA)操作的55位疑诊肺癌者进行分组处理，发现有ROSE指导操作的一组诊断阳性率明显高于非ROSE组，提示ROSE 可以提高诊断阳性率，减少无谓取材，降低并发症风险[3]。前十余年C-ROSE技术国外报道多用于胰腺、甲状腺穿刺等方面[4-6]，在呼吸介入领域应用较少，近年来由于各种呼吸内镜和导航技术的发展，C-ROSE在呼吸介入领域的作用日益突出[7]，国内目前已有少数医疗机构开展该项技术，并取得良好效果[1]。

C-ROSE 技术的操作方法

C-ROSE是指取材现场对标本玻片进行快速染色并采用光学/荧光显微镜实时判读细胞学病理，其具体操作分为：制片→染色→阅片判读三步骤。由于ROSE目的是实时指导介入现场进程，故其技术核心在于两点：① 尽可能提高制片和染色的速度；② 准确判读细胞学结果。

目前ROSE的快速制片方式主要有以下几种[8]：①印片(又称滚片)法，适用于：支气管镜病灶黏膜活检、肺穿刺活检、内科胸腔镜活检取材等实质性组织块；②喷片(又称画片)法：适用于C-TBNA、EBUS-TBNA、FNA等针吸标本；③涂片(又称刷片)法：用于多数经支气管镜、胸腔镜防污染毛刷取材的标本；或含粘液的标本；④液基薄层细胞制片法(TCT)法：用于胸腔积液、支气管灌洗液、FNA、TBNA的标本。

标本制片成功后即予染色，目前用于C-ROSE的染色剂主要有：① 改良快速瑞氏-姬姆萨染色(modified rapid Papanicolaou stain)：是在瑞氏-姬姆萨染色基础上改良而成的一种快速染色，45 s 即可完成，具体步骤：先滴加染色液覆盖细胞涂片区域，再加二倍蒸馏水混匀，水洗待干镜检。该方法特点：灵敏度及特异性较高，胞核显示清晰，操作简便，单人可行，C-ROSE染色可予采用[9-10]。② 改良快速巴氏染色(modified rapid Papanicolaou stain)：也是一种较常用的快速染色法。有研究认为其灵敏度、诊断率都较高[11]，但巴氏标本染色操作需15个步骤，耗时约3 min，在C-ROSE 过程中多需技师帮助，故其临床应用受到一定限制。③ 迪夫快速染色(Diff-quik stain) 试剂：是在瑞氏染色基础上加以改良所形成的一种极快速染色剂，由甲醇固定液、伊红、亚甲蓝组成的试剂组套。该染色耗时仅约30s，大多于60s内即可在显微镜下观察，简便、快速、高效，是C-ROSE 最常用的染色方式，也是现阶段WHO唯一推荐的标准ROSE染色方法[12]，亦多为国内开展C-ROSE的医院所采用[1]。

除外上述试剂外，也有少数研究认为HE染色在EBUS-TBNA-C-ROSE中[13]，Hemacolor染色在内科胸腔镜标本中[14]，可呈现良好染色效果。

虽然各种染色剂各有优势，但基于C-ROSE为快/极速染色，难认进行常规病理标本洗脱，因此如何甄别标本背景污染，剔除无价值制片，把握ROSE的质量控制——这些仍是令人关注的问题，现已有部分研究对此展开探索。Sun Mi Choi等认为：大于2cm的组织、碳末色素沉着、淋巴细胞密度等因素或与C-ROSE标本质量相关[15]；Daisuke Minam等在C-ROSE-TBNA 过程中采用BIOEVALUATOR®装置来分选出现合乎条件的标本。Bioevaluator 是一种可以区别组织还是其他成分(例如血液)的装置，C-ROSE评估中组织成分呈现为白色，血液等，则呈现为红色[16]。新近有“一站式快速诊断”之称的波谱库ROSE技术，则可将ROSE制片波谱与波谱库进行快速对照，从而得到诊断，改变了传统C-ROSE细胞学概念，是对ROSE技术的创新[17]。这些研究表明现代C-ROSE技术已得到更进一步的重视和发展。

C-ROSE 在诊断性介入呼吸病学中的应用

近年来随着各种导航技术和各类型内镜的长足发展，介入呼吸病学已成为现代呼吸专科最活跃的分支之一，为经人体自然腔道进行呼吸病诊断提供了广阔空间。C-ROSE技术可在呼吸介入现场进行实时评估，给内镜医师予快速反馈，帮助制定临床操作策略，可谓是诊断性呼吸介入的“伴侣技术”。下文对其应用予以具体介绍。

一、C-ROSE配合呼吸介入新技术在呼吸系统疾病诊断中的应用

1 肺门和纵隔病灶的诊断和纵隔淋巴结分期

肺门和纵隔病灶(包括淋巴结)的病理诊断是呼吸病的难点之一，以往多需纵隔镜进行，创伤风险大，医疗投入高，需一定条件的医院方可开展。经支气管镜超声针吸(EBUS-TBNA)通过超声引导，可对普通支气管镜下无法发现的肺门、纵隔病灶进行取材，在肺门纵隔疾病诊断和肺癌患者淋巴结分期方面具有独特优势。国外大量文献表明，C-ROSE技术配合EBUS-TBNA或C-TBNA，可以减少不必要的穿刺，减少操作相关并发症，指导现场操作进程，提高诊断阳性率。Collins等联合TBNA和C-ROSE取材，发现ROSE组可减少33%的无谓穿刺和30%的无谓涂片；有68%的患者由于使用了C-ROSE技术，使得TBNA一次穿刺即获得成功[7]。2015年Cancer letters报道，将236例肺癌合并肺门纵隔淋巴结大的患者分为ROSE(122人，252个淋巴结)和非ROSE(114人，260个淋巴结)两组，进行EBUS-TBNA术，用未确诊率来比较二组诊断效能。结果发现，ROSE组中细胞学、组织学的未诊断率均低于非ROSE组，数据分别是8.7%vs.14.6%，P=0.038；0.9%vs4.4%，P=0.018。该研究提示在EBUS-TBNA中采用ROSE技术可降低无效标本率，帮助获取阳性诊断[18]。

Rokadia等[19]对625例平均直径约14.4(±7.9)mm的纵隔肿大淋巴结患者进行TBNA+C-ROSE检查，发现ROSE确诊肺门纵隔良性肉芽肿病变的结果与最终病理的符合率达81.6%，该研究表明，不仅恶性疾患，C-ROSE技术也可帮助肺门纵隔良性病灶进行现场快速诊断。

然而，也有不同观点表明C-ROSE并未帮助提高TBNA的阳性诊断率。例如，Liu QH等回顾研究认为C-ROSE有助于指导EBUS-TBNA操作进程，但并未提高TBNA的病理诊断率[20]。Monaco SE等研究认为，C-ROSE对EBUS-TNBA的诊断率无明显影响，但有助于保障标本的有效性和充足度，能为流式细胞、免疫染色和分子病理学等后继检测提供优选标本[21]。Madan等按照1 ∶1 ∶1 ∶1将80例患者分为常规TBNA+ROSE、常规TBNA、EBUS-TBNA+ROSE和单纯EBUS-TBNA共4组，操作结果发现常规TBNA中，联合ROSE组的患者诊断率高于非ROSE组，在EBUS-TBNA两组中，有无采用ROSE对诊断率无明显影响，这与和Liu QH和Monaco SE等观点类似。这项研究还发现，联合ROSE组的患者在介入操作中镇静剂使用量和操作时间均低于未采用ROSE组[22]。

2 肺外周型病灶

Steinfort DP[23]等对128例肺外周型病灶(pulmonary peripheral lesion, PPLs)患者进行前瞻性队列研究，在径向超声(radial probe endobronchialultrasound,R-EBUS)引导下进行标本取材，发现取材所耗时间，C-ROSE组 vs 非ROSE组=(19±8)min vs(31±11)min，Plt;0.0001。C-ROSE组的诊断阳性率达97%，且未见明显操作并发症故认为ROSE+R-EBUS的法有助于提高外周型肺癌的诊断率，缩短操作时间，降低并发症风险。Chen 等[24]对815 例肺外周病变患者进行R-EBUS引导下的经支气管刷检或肺活检，其中279 例患者被随机挑出，接受C-ROSE。研究结果发现，肺外周病变的诊断率：C-ROSE 组 vs非C-ROSE 组：88.9% vs 74.5%，有统计学差异，提示C-ROSE 有助于提高肺外周病变的诊断效能。报道中还发现，对于右肺尖、左舌段等一些较难取材部位的病变，C-ROSE 组vs 非C- ROSE 组的诊断率是77.4% vs 56.8%，仍有统计学差异。上述研究表明径向支气管腔内超声联合C-ROSE技术，可有助于准确合理取材，提高PPLs的诊断效能，并降低并发症风险。

3 胸膜病变中的应用

部分较难诊断的胸膜或胸壁病变需取得组织病理，但胸膜、胸壁面积较广，如何能有效、成功地取材？是介入操作的关键。Profyrides等对61例接受内科胸腔镜的患者进行C-ROSE，发现ROSE现场诊断恶性病率86%，敏感度79%，特异度95%，阳性诊断率89%，结论认为：C-ROSE配合内科胸腔镜，能提高胸膜恶性疾病的诊断率，帮助腔镜医师现场制定取材策略[14]。Mfokazi A等对胸部占位灶予以经胸壁穿刺术取材，查液基、涂片、组织病理，结果表明，常规液基病理的诊断率明显低于涂片细胞病理，然而加入C-ROSE参与修正指导后，液基病理学诊断率明显提高[25]。

上述各项研究提示，无论是位于中央、外周、或胸膜的呼吸系统病变，联合采用C-ROSE技术，均可提高合理取材率，提高诊断效能，令患者获益。

二、C-ROSE在呼吸系疾病分子生物学检测中的应用

由于ROSE技术可帮助取得合理有效充足的标本，使得对优选标本进行后继检测成为可能[21]。阳性的C-ROSE标本可用于做细胞块；或继续流式细胞、免疫染色和分子生物学检测，为制定临床决策和个体化治疗提供重要帮助。Celik B等对确诊为非小细胞肺癌的75例患者癌组织标本进行C-ROSE和甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)、p53免疫组化染色，结果发现，C-ROSE联合IHC等技术可帮助未分类-非小细胞肺癌的分型[26]。2015年Chest报道在126例进展期肺癌患者中完成了108例基因分型检测，发现采用ROSE组的患者能以最小量组织获得肺癌病理分析，其取材进行基因分型的成功率约90.8%，大于未采用ROSE组[27]。这些研究提示，C-ROSE技术或许可使现场快速诊断到分子病理的宏—微观一体化转变成为可能。

C-ROSE的操作者

C-ROSE的快速制片染色方法，普通临床、医技工作者，通过短期学习都可掌握，而C-ROSE的阅片判读才是现场评估的重点。依据Guidelines ofthe Papanicolaou Society of Cytopathology 的指导，目前C-ROSE标本的判读结果及满意度可分为C1-C5五类：C1 ：无诊断价值的标本或标本不适当，即无效标本；C2 ：良性病变；C3：良、恶性均有可能；C4 ：可疑恶性；C5：恶性病变[28]。C-ROSE是否成功，关键在于操作者制片阅片的经验水平。既往有关C-ROSE的研究文献多倾向于由细胞病理学家进行判读。诚然，病理科医师的专业知识对C-ROSE诊断极具价值；然而，国内医疗机构的病理科医师大多工作繁忙，无法派出长期、固定人员进行此项工作，同时，劳务分配层面也存在一定操作困难，故不易推广。国外曾报道生物医学科学家帮助判读C-ROSE[12]，但成本较高，尚处于尝试阶段。令人鼓舞的是，呼吸介入医师因熟悉患者病史，临床特征，影像学，血、痰等临床资料结果，同时具有临床专科逻辑整合能力，因此自己开展C-ROSE工作判读实具天然优势；如能经过专科培训，也可胜任C-ROSE的现场阅片诊断任务。2014年Chest杂志发表的一项研究表明，肺科医师经过3个月的细胞病理学知识培训后，进行C-ROSE，准确率达80%，与细胞病理学家92%的准确率相比，未见统计学差异[29]。作者所在呼吸腔镜中心初步开展C-ROSE工作，现约150例，大部分由呼吸介入医师判读，少部分细胞形态疑难或不典型者请病理科医师到场指导阅片。初步评价，经呼吸介入医师判读的C-ROSE为恶性疾病者，与最终病理结果的符合率约93%，支持Chest杂志的研究观点。故此认为，呼吸介入医师开展C-ROSE工作具有较好前景，且能节约医院人力资源。

小结与展望

虽然C-ROSE在提高呼吸系疾病诊断率的价值还有争议[20]，但该技术在快速现场评估标本充足度、减少不必要取材，缩短操作时间，降低并发症，节约医疗资源，帮助制定临床诊疗策略等方面均具有积极意义。同时，虽已出现关于ROSE的盲法试验[30]，但进一步客观评估C-ROSE在呼吸介入诊断方面的应用价值还需更多前瞻性、多中心、大样本的随机对照研究。总言之，随着精准医学诊疗理念的普及，各种呼吸导航技术[31]的发展、生物科技中数学模型的优化[15]以及远程信息学[32]的参与，相信C-ROSE技术在呼吸介入领域的实际应用将更具广阔空间，有条件的单位机构和呼吸科医师宜重视投入开展C-ROSE，以便帮助临床制定个体化诊疗策略，更好地服务于病患。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.043

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