兔膝关节开放性海水浸泡损伤模型的构建

李文，曾国庆，陈爱宝，杨学洪，穆继宏

(中国人民解放军第425医院骨科，海南 三亚572008)

兔膝关节开放性海水浸泡损伤模型的构建

李文，曾国庆，陈爱宝，杨学洪，穆继宏

(中国人民解放军第425医院骨科，海南 三亚572008)

目的 探索并构建理想的兔膝关节开放性海水浸泡损伤的动物模型。方法 取新西兰白兔60只，建立兔膝关节开放性损伤模型，按照不同的海水浸泡时间分为对照组、0.5 h组、1 h组、3 h组和6 h组，每组各12只。对照组不予处理，各实验组制备膝关节开放性伤口，分别给予相应的海水浸泡时间。术后观察实验动物伤口及存活情况，于术后7 d抽取各组白兔膝关节液，采用酶联免疫吸附法检测关节液中炎性因子白细胞介素1-β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果3 h组和6 h组的7 d存活率分别为91.7%、75.0%，其余各组均为100.0%；1 h组、3 h组和6 h组的14 d存活率分别为91.7%、83.3%和58.3%，其余各组均为100.0%。术后7 d，3 h组和6 h组中关节液IL-1β水平分别为(37.50±6.1)pg/mL和(38.40±5.1)pg/mL，明显高于其他各组，差异均有统计学意义(P＞0.05)，而3 h组和6 h组中关节液IL-1β水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)；术后7 d，1 h组和3 h组关节液中的TNF-α水平分别为(297.48±35.7)pg/mL和(312.84±34.0)pg/mL，高于0.5 h组和对照组，低于6 h组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而1 h组和3 h组关节液中的TNF-α水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 海水浸泡3 h构建兔膝关节海水浸泡损伤的动物模型具有动物存活率高、炎性反应活跃等特点，是一种理想的关节开放性海水浸泡损伤的动物模型。

膝关节；海水浸泡；动物模型；兔

随着人们对海洋的不断认识和探索，海水浸泡损伤在战创伤中所占的比例不断增大。本实验的目的是建立合理的膝关节开放性海水浸泡损伤动物模型，了解动物模型的病理机制，提高关节海水浸泡伤的临床处理水平。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取普通新西兰白兔60只，体质量(2.4±0.2)kg，雌雄不限。全部实验动物随机分为五组，每组12只。其中4组按膝关节外伤后海水浸泡时间分为0.5 h组、1 h组、3 h组和6 h组，另1组实验动物不予如何处理，作为对照组。

1.2 实验模型的制备 各实验组白兔按0.l mL/kg给予速眠新肌注麻醉，四肢固定在实验台上，单侧膝关节去毛，常规消毒、铺单。沿髌旁内侧做约2.5cm的横行切口，逐层切开至关节囊，直至关节腔，暴露关节软骨面。在自然天气情况下将各组家兔患膝伤口在海水中分别浸泡0.5h、1h、3h和6h，浸泡结束后用无菌生理盐水冲洗关节腔，依次缝合伤口。对照组白兔不予处理。术后全部实验动物按常规分笼喂养。

1.3 检测指标

1.3.1 临床观察 大体观察实验动物的伤口情况、关节活动度等，比较各组间术后7 d和14 d的生存率。

1.3.2 关节液炎性因子指标 于术后第7天按相同方式麻醉、消毒，采用注射器于膝关节外侧间隙向关节腔内注射1.0mL无菌生理盐水，待充分混匀后抽取1.0mL关节液备用。样本置于离心管中，1 500r/min离心20min，-70℃保存待测。采用ELISA试剂盒检测各样本中白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平。

2 结果

2.1 术后7 d和14 d各组白兔的生存率比较 全部实验动物术后第1天均能站立，伤口无明显渗出，局部皮肤无红肿。术后第3天，3 h组和6 h组部分实验动物患膝出现肿胀，局部皮温高，伤口无明显渗出。术后第5天，1 h组1例实验动物患膝出现红肿，皮温稍高。术后14 d临床观察，存活的实验动物中，仅6 h组出现1例伤口不愈合，见表1。

表1 术后7 d和14 d各组生存率比较[只(%)]

2.2 术后7 d各组白兔关节液中IL-1β和TNF-α的水平 术后7 d，各组兔膝关节液中IL-1β和TNF-α的水平比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。3 h组和6 h组的IL-1β水平明显高于0.5 h组和1 h组(P＜0.05)，且0.5 h组和1 h组的IL-1β水平高于对照组(P＜0.05)；此外，6 h组的TNF-α水平明显高于1 h组和3 h组(P＜0.05)，且1 h组和3 h组的TNF-α水平明显高于对照组和0.5 h组。这表明长时间的海水浸泡容易引发更严重的炎症反应，见表2。

表2 术后7 d各组白兔膝关节液IL-1β和TNF-α水平比较(±s，pg/mL)

表2 术后7 d各组白兔膝关节液IL-1β和TNF-α水平比较(±s，pg/mL)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与0.5 h组比较，bP＜0.05；与1 h组比较，cP＜0.05；与3 h组比较，dP＜0.05。

组别对照组0.5 h组1 h组3 h组6 h组F值P值只数12 12 12 11 9 IL-1β 25.49±2.8 30.21±5.8a31.58±4.7a37.50±6.1abc38.40±5.1abc13.694＜0.05 TNF-α 252.00±57.9 254.77±38.1 297.48±35.7ab312.84±34.0ab353.62±32.3abcd13.100＜0.05

3 讨论

海水是一种较为复杂的致伤因素，当机体出现开放性损伤，海水浸泡将加重创伤后机体的病理生理改变，从而导致不同的预后及治疗方案[1-2]。由于关节内的组织结构复杂，且软骨、滑膜等组织自愈能力欠佳，故建立合适的关节内海水浸泡伤动物模型将有助于了解其病理改变，提供合理的临床治疗方案。

有学者研究证明，高渗液体可刺激单核细胞内炎性介质基因的表达[3]。发生海水浸泡伤后，与创伤愈合的相关蛋白早期表达减弱以及机体对海水中致病菌的暴露，都可能是影响组织愈合的因素[4-5]。林建宁等[6]观察了家兔海水浸泡开放性骨折的特点，发现海水浸泡使伤口的感染率增高，骨折愈合的满意率下降，骨痂形成不良率增高，骨折愈合过程延迟[7]。笔者假设海水浸泡对膝关节开放性损伤产生重要的影响，在关节及全身感染率、关节内组织不可逆损伤、关节液中炎性因子的表达等方面发挥作用，那么通过比较不同海水浸泡时间的差别，可以总结出致死率低、关节内炎性改变明显的兔膝关节海水浸泡伤模型。

本实验发现，海水浸泡6 h的动物模型生存率相对较低，伤口周围炎性反应较其他各组明显。这可能与关节内和全身感染相关，全身性炎症反应致多器官功能障碍。尽管此组动物模型能够提供足够严重的关节损伤，但造模过程中实验动物的损失较多，造模失败率及经济损伤过大；相对而言，0.5 h、1 h和3 h组的实验动物具有更高的存活率。

关节液中炎性因子的水平可以间接反映关节内炎症反应的程度，动物实验发现，海水浸泡可以使损伤组织内的炎性因子含量升高并参与组织继发损伤，TNF-α、白介素-8(IL-8)、NO的含量在浸泡后3～36 h内明显较单纯损伤高[8]。本研究发现，术后7 d，1 h、3 h和6 h组的兔膝关节液中IL-1β和TNF-α的水平均高于对照组，表明海水浸泡损伤是兔膝关节炎性反应较为敏感的致伤因素。同时，海水浸泡0.5 h和1 h的实验动物关节液中IL-1β水平明显低于3 h和6 h组；海水浸泡1 h和3 h的实验动物关节液中TNF-α的水平明显低于6 h组，说明海水浸泡时间会影响关节液中炎性因子的水平。从实验结果看出，1 h、3 h及6 h的海水浸泡时间均能够造成兔海水浸泡伤模型膝关节的炎性反应，浸泡时间越长，炎性因子水平升高越明显。长时间的海水浸泡使关节组织内的渗透压改变，合并特殊致病菌感染等因素，发生一系列病理生理改变，大量炎性因子介入，最终导致关节内不可逆的组织损伤[9]。

海水浸泡致膝关节损伤的作用机制十分复杂，本研究的造模过程未能纳入关节损伤和海水浸泡伤的全部致伤因素，如低体温、复合损伤、关节内骨折等。这些因素能够在不同程度上改变损伤的进程，随着研究的深入，尚需进一步的实验逐步完善此动物模型。

综上所述，采用1 h、3 h及6 h海水浸泡兔膝关节的造模方法可以提高关节液中的炎性因子水平，但6 h海水浸泡的实验动物存活率较低，因而1 h和3 h的海水浸泡时间可以满足兔膝关节海水浸泡损伤的造模需要，而3 h的浸泡时间更容易引发造模所需的炎症反应。该兔膝关节海水浸泡损伤模型可应用于进一步研究，在损伤分型、病理改变和早期救治等方面发挥作用。

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Establishment of a rabbit model of seawater immersion after knee injury.

LI Wen,ZENG Guo-qing,CHEN Ai-bao, YANG Xue-hong,MU Ji-hong.Department of Orthopedics,the 425thHospital of Chinese PLA,Sanya 572008,Hainan, CHINA

ObjectiveTo explore and construct a rabbit model of seawater immersion after knee injury. MethodsSixty rabbits of knee injury were randomly divided into five groups:control group,0.5 h group,1 h group, 3 h group and 6 h group.The control group was subjected to simple knee injury,and other groups received seawater immersion of different duration respectively.The wound and survival was observed.After 7 days,the content of interleukin-1 β(IL-1 β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the synovial fluid in each group was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe 7-d survival rate was 91.7%in 3 h group,75.0%in 6 h group,and 100.0%in other groups.The 14-d survival rate was 91.7%in 1 h group,83.3%in 3 h group,58.3%in 6 h group,and 100.0%in other groups.Seven days after treatment,the IL-1β levels of synovial fluid in 3 h group and 6 h group showed no statistically significant difference,which were(37.50±6.1)pg/mL and(38.40±5.1)pg/mL,but they were significantly higher than those in other groups.Seven days after treatment,the TNF-α content of synovial fluid in 1 h group and 3 h group,(297.48±35.7)pg/mLand(312.84±34.0)pg/mL respectively,were significantly higher than that in 0.5 h group and control group but lower than that in 6 h group(P＜0.05).ConclusionThe models of seawater immersion for 3 hours after knee injury have higher survival rate and more inflammatory reactions,which are recommended.

Knee;Seawater immersion;Animal model;Rabbits

R-332

A

1003—6350（2017）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.004

2016-07-07)

海南省三亚市医疗卫生科技创新项目（编号：2014YW47）

穆继宏。E-mail：mu.jihong@hotmail.com