NLRs信号转导通路在真菌感染中的作用机制

彭阳，史伟峰

(苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 213003)

·综述·

NLRs信号转导通路在真菌感染中的作用机制

彭阳，史伟峰

(苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 213003)

核苷酸结合寡聚域样受体(NLRs)是一类存在于胞质中的模式识别受体(PRRs)。NLRs通过识别病原体相关分子模式(PAMPs)，激活下游信号转导通路，诱导细胞因子分泌，在抵抗病原菌入侵及维持机体免疫系统稳定的过程中起着重要作用。近年来，真菌感染逐年上升，而NLRs在真菌感染的相关疾病中发挥作用。研究NLRs及其下游信号转导通路,将对真菌感染性疾病的免疫调节和临床治疗提供思路。该文就NLRs信号转导通路在真菌感染中的作用机制作一综述。

NLRs信号转导通路；固有免疫；真菌感染

模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)是指单核/巨噬细胞和树突状细胞等固有免疫细胞表面或胞浆、胞内器室膜上和血清中一类能够直接识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)或宿主凋亡细胞和衰老细胞表面某些共有特定分子结构的受体。PRRs对PAMPs的识别作用是启动固有免疫应答的关键。

目前发现的PRRs主要包括Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)、维甲酸诱导基因I样受体(RIG-I like receptors，RLRs)、核苷酸结合寡聚域样受体(Nod like receptors，NLRs)、C型凝集素样受体(C-type lectin receptors，CLRs)、DNA依赖的干扰素调节基因激活因子(DNA-dependent activator of interferon regulatory factor，DAI)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)等[1]。其中，TLRs和CLRs在抗真菌感染免疫中的作用已得到证实[2-4]。目前发现NLRs信号转导通路在真菌感染过程中发挥着重要作用，本文就其在真菌感染中的作用机制研究进展作一综述。

1 NLRs家族

1.1 NLRs家族基因定位 NLRs家族是一类进化上比较保守的蛋白质。哺乳动物体内存在少量的NLRs蛋白质[5]。迄今为止，NLRs家族已有至少22种人类成员和34种鼠源成员[6]。22种人类成员中，NLRA编码基因定位于16p13.13；NLRB定位于5q13.2；NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC4、NLRC5、NLRX1分别定位于7p14.3、16q12.1、16p13.3、2p22.3、16q13、11q23.3；NLRP1定位于17p13，NLRP2、NLRP7、NLRP12定位于19q13.42，NLRP3定位于1q44， NLRP4、NLRP5、NLRP8、NLRP9、NLRP11、NLRP13定位于19q13.43，NLRP6定位于11p15.5，而NLRP10、NLRP14则定位于11p15.4[7]。

1.2 NLRs家族分类 NLRs具有3个共同的结构域: N末端效应器结构域，位于中心的核苷酸结合寡聚化结构域(NACHT结构域)，C末端的亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)[8]。NACHT结构域本身包含1个ATP酶核苷酸结构域(nucleotide-binding domain，NBD)、1个螺旋结构域1(helical domain 1，HD1)和1个翼螺旋结构域(winged-helix domain，WHD)，主要调节依赖ATP的NLRs寡聚化。C末端的LRR区域主要负责识别配体和调节NLRs活性，在NACHT结构域和LRR结构域之间存在螺旋域2(helical domain 2，HD2)[9]。N末端效应器结构域通过和其他蛋白质之间的相互作用发挥效应器的功能[10]。根据N末端效应器结构域的差异可将NLRs分为4类亚家族：酸性转录激活结构域(the acidic transactivation domain，TA/NLRA)、杆状病毒抑制重复结构域(the baculoviral inhibitory repeat-like domain，BIR/NLRB)、半胱天冬酶激活和招募结构域(the caspase activation and recruitment domain，CARD/NLRC)、热蛋白结构域(the pyrin domain，PYD/NLRP)[7]。NLRA亚家族只有MHCⅡ类反式激活蛋白(the MHC-Ⅱ transactivator，CⅡTA)1个成员；NLRB亚家族在N末端存在1个BIR结构域，在人类仅发现神经元凋亡抑制蛋白(NAIP) 1个成员，而鼠源中存在NAIP1-6个成员[11]。NLRC亚家族由NLRC1(NOD1)、NLRC2(NOD2)、NLRC3、NLRC4、NLRC5和NLRX1 6个成员构成，而NLRC3、NLRC5和NLRX1并没有确定的NH2端结构域，归类于这个亚家族是由于其系统发育关系和同源性。NLRC亚家族的特点是含有1个或2个CARD结构域，可以通过招募半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)传递下游信号[12]。NLRP亚家族由NLRP1-14构成。其中NLRP1、2、3、6、7、12和NLRC4、5可参与炎症小体的组装[13-15]。

研究表明，NLRs具有识别病原微生物、参与组织和器官的损伤、控制细胞死亡等多种生物学功能[16]。活化后的NLRs可参与自噬、信号转导、转录激活和炎性小体的形成等过程[17]，主要诱导NF-κB途径、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径及炎症小体信号通路活化，刺激各种炎症因子或趋化因子合成、释放，启动固有免疫应答和适应性免疫应答。

2 NLRs信号转导通路在真菌感染中的作用及机制

固有免疫是宿主抵御入侵病原微生物的第一道防线。目前发现与真菌感染密切相关的NLRs主要有NOD1、NOD2、NLRC4、NLRP3及NLRP10,其能够识别真菌的菌丝、几丁质、葡聚糖等成分。

2.1 NOD1和NOD2信号通路 NOD1和NOD2是哺乳动物NLRs家族中最先发现的细胞内微生物探测元件。NOD1广泛表达于多种类型的细胞中，而NOD2主要存在于巨噬细胞、树突状细胞、成骨细胞和肺、肠等上皮细胞中[18]。研究表明，NOD1主要识别内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)，NOD2主要识别细菌胞壁中的胞壁酰二肽(MDP)，其可激活相同的信号通路，目前已知的下游信号通路包括NF-κB通路和MAPK通路[19]。

近年来研究发现NOD1和NOD2协同CLR和TLR在真菌感染的免疫应答反应中起着重要作用。Patin等[20]用近平滑念珠菌刺激小鼠骨髓源巨噬细胞(BMDMs)，发现TLR7和NOD2的表达增加；而用近平滑念珠菌分别刺激髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)和 TLR7缺失型、NOD2缺失型、IFNAR1和STAT1/2缺失型的BMDMs，发现IL-27的分泌减少，表明TLR7/MyD88、NOD2和IFN-β在近平滑念珠菌诱导巨噬细胞分泌IL-27的过程中发挥重要作用。此外，用近平滑念珠菌感染IL-27受体缺失型小鼠，发现IFN-γ和IL-17的效应作用增强，病原体的清除能力明显强于野生型小鼠，提示在感染近平滑念珠菌后，通过阻断IL-27的调节作用可成为治疗真菌感染的策略之一。Wagener等[21]证实NOD2和TLR9可识别白念珠菌胞壁中的几丁质，利用几丁质刺激人外周血单核细胞(hPBMCs)后抗炎因子IL-10和炎性因子IL-6、TNF的分泌显著增加，而几丁质刺激小鼠巨噬细胞后只有抗炎因子IL-10分泌增多。当用几丁质刺激NOD2缺失型和TLR9缺失型小鼠巨噬细胞后，发现IL-10分泌显著减少，说明NOD2和TLR9在识别真菌几丁质后可通过诱导IL-10的分泌，共同抵抗炎症损害，并维持免疫平衡体系。Zhang和Wu等[22-23]利用灭活的烟曲霉孢子刺激未经处理的人角膜上皮细胞(HCECs)，发现NOD1及其下游信号分子RIP2和NF-κB P65的表达显著增高。而当烟曲霉感染敲除NOD1基因的HCECs后，NOD1及其下游信号分子RIP2、NF-κB P65以及促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达减少，并且诱导的免疫应答反应减弱，提示NOD1信号转导通路在真菌性角膜炎的固有免疫应答中发挥重要作用。随后利用烟曲霉孢子刺激HCECs，发现TLR2、NOD2及其下游信号分子RIP2 和IκB-α的表达上调，而阻断TLR后NOD2、RIP2 和IκB-α表达水平降低，提示NOD2与TLR2在真菌性角膜炎引起的免疫反应中共同发挥作用，且TLR2可能对NOD2的表达存在调节作用。因此，在真菌感染过程中NLRs可能需协同TLRs激活下游信号通路及诱导炎症细胞因子的分泌。

2.2 NLRC4炎性小体 NLRC4又称作人IL-1转化酶蛋白酶激活因子(ICE-protease-activating factor，IPAF)，在骨髓细胞中表达。在正常情况下，NLRC4处于自抑制静息状态，病原体进入细胞后可被NAIP亚家族蛋白识别，进一步激活NLRC4并发生自身多聚化，招募caspase-1，与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)结合形成炎症小体，剪切pro-IL-1β和pro-IL-18而成为活性分子，从而诱导一系列的免疫应答反应[24]。Tomalka等[25]用白念珠菌感染野生型小鼠，发现小鼠舌背上皮细胞中性粒细胞浸润程度增高，同时口腔黏膜细胞中NLRC4、IL-1β、IL-6和IL-17的表达上调；而白念珠菌感染NLRC4缺失型小鼠后则相反，表明NLRC4的激活需要募集中性粒细胞浸润感染组织部位，证实NLRC4在黏膜组织抵抗白念珠菌感染的早期发挥特定作用。然而，白念珠菌如何激活NLRP4炎性小体的确切分子机制尚未阐明，有待于进一步研究。

2.3 NLRP3炎性小体 目前NLR家族中以NLRP3炎性小体的研究最多。NLRP3炎症小体是一种存在于巨噬细胞和树突状细胞等胞质中的多蛋白复合物，主要由NLRP3、ASC和caspase-1相互结合而成，其功能是调节caspase-1的活化并促进pro-IL-1β和pro-IL-18剪切为IL-1β和IL-18两种炎性因子，IL-1β可促进炎症反应及激活TH17细胞，IL-18可刺激NK细胞和TH1细胞分泌IFN-γ[26]，二者作用于相应的免疫细胞后便激活整个免疫系统以清除入侵的病原体[27]。

NLRP3炎症小体不仅能通过依赖caspase-1的方式调节NF-κB信号途径的激活及下游细胞因子的产生[28]，也可通过P38 MAPK信号通路和TAK1/JNK途径的激活发挥调节作用，诱发炎症反应及细胞坏死[29-30]。Ketelut-Carneiro等[31]研究显示，活体巴西副球孢子菌才能诱导IL-18的分泌和caspase-1的活化，且该菌激活NLRP3炎症小体的过程取决于K+外流和溶酶体的酸化，诱导产生的IL-18可激活TH1引起强烈的免疫应答反应，最终增强宿主对真菌的防御能力。此外，用巴西副球孢子菌分别感染NLRP3基因敲除、ASC基因敲除、caspase-1基因敲除和野生型小鼠，发现基因缺失型小鼠IFN-γ的分泌减少且TH1应答反应减弱，说明IFN-γ在抗巴西副球孢子菌感染的免疫机制中发挥重要作用。Joly等[32]用白念珠菌感染巨噬细胞，然后用细胞松弛素D或B抑制巨噬细胞的内吞作用，导致细胞分泌IL-1β的过程受阻，同时发现白念珠菌由酵母相向菌丝相转变的能力对炎性小体的激活至关重要。Bruno等[33]在NLRP3基因敲除的小鼠阴道内接种白念珠菌，发现阴道灌洗液中中性粒细胞水平降低，炎性因子IL-1β、IL-12p70、IL-6、MIP-1b和危险信号分子S100的分泌显著减少，导致机体对真菌的清除能力减弱，提示NLRP3炎症小体在机体抗念珠菌感染的免疫反应中起保护作用。Said-Sadier等[34]证明烟曲霉感染的固有免疫反应涉及2个信号传递过程：一是由TLR 和dectin-1共同作用，促进pro-IL-18的表达；另一个是由Syk激酶诱导的NLRP3炎性小体和caspase-1的激活，剪切加工并分泌成熟细胞因子。实验利用烟曲霉的菌丝和孢子刺激THP-1细胞，发现只有烟曲霉的菌丝可上调THP-1细胞中pro-IL-18的表达并诱导IL-1β的分泌，且菌丝诱导的caspase-1激活和IL-1β的分泌过程依赖于K+外流和活性氧物质(ROS)的产生。上述研究初步证实真菌感染后NLRP3炎症复合体参与IL-1β等因子介导的炎症反应，但NLRP3炎症小体和其他固有免疫受体协调发挥作用的机制仍未阐明。

2.4 NLRP10信号通路 NLRP10主要存在于人和小鼠的肾脏、睾丸和结肠中，是唯一不具有LRR结构域的NLR蛋白，目前推测NLRP10可能只发挥调控作用，而不能直接识别PAMPs。NLRP10可与RIP2、TAK1和NEMO等多种蛋白质相互作用以增强NOD1调控的免疫反应，也可通过其PYD结构域和接头蛋白ASC作用形成多蛋白复合物，然后作用于caspase-1而负调控NLRP3炎性小体的激活过程[35]。Joly等[36]用白念珠菌分别感染NLRP10基因敲除野生型小鼠，发现基因敲除小鼠体内IFN-γ和IL-17的分泌严重减少，表现为特异性TH1和TH17应答反应严重缺陷，说明NLRP10在白念珠菌诱导的适应性免疫应答反应过程中发挥作用。

3 小结及展望

NLRs通过识别真菌的多种PAMPs，诱导固有免疫应答，并激发适应性免疫反应而发挥重要作用。然而对于NLRs如何识别配体，启动下游信号通路的具体机制，以及与其他PRRs间的相互作用机制等仍需进一步研究。目前，一些针对炎症小体的药物已经开始用于某些炎症性疾病的治疗。随着研究的不断深入，NLRs及其信号通路中相关分子有望在不久的将来成为有效的新型生物药物靶点，为临床抗真菌感染提供新的途径。

[1]Sellge G，Kufer TA. PRR-signaling pathways: Learning from microbial tactics[J]. Semin Immunol，2015，27(2): 75-84.

[2]Tapia CV，Falconer M，Tempio F,etal. Melanocytes and melanin represent a first line of innate immunity againstCandidaalbicans[J]. Med Mycol，2014，52(5): 445-454.

[3]Wevers BA，Kaptein TM，Zijlstra-Willems EM,etal. Fungal engagement of the C-type lectin mincle suppresses dectin-1-induced antifungal immunity[J]. Cell Host Microbe，2014，15(4): 494-505.

[4]Deng Z，Ma S，Zhou H,etal. Tyrosine phosphatase SHP-2 mediates C-type lectin receptor-induced activation of the kinase Syk and anti-fungal TH17 responses[J]. Nat Immunol，2015，16(6): 642-652.

[5]Howe K，Schiffer PH，Zielinski J,etal. Structure and evolutionary history of a large family of NLR proteins in the zebrafish[J]. Open Biol，2016，6(4): 160009.

[6]Hibino T，Loza-Coll M，Messier C,etal. The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome[J]. Dev Biol，2006，300(1): 349-365.

[7]Ting JP，Lovering RC，Alnemri ES,etal. The NLR gene family: a standard nomenclature[J]. Immunity，2008，28(3): 285-287.

[8]Coutermarsh-Ott S，Eden K，Allen IC. Beyond the inflammasome: regulatory NOD-like receptor modulation of the host immune response following virus exposure[J]. J Gen Virol，2016，97(4): 825-838.

[9]Lechtenberg BC，Mace PD，Riedl SJ. Structural mechanisms in NLR inflammasome signaling[J]. Current Opinion in Structural Biology，2014，29: 17-25.

[10]Parlato M，Yeretssian G. NOD-like receptors in intestinal homeostasis and epithelial tissue repair[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15(6): 9594-9627.

[11]Kofoed EM，Vance RE. Innate immune recognition of bacterial ligands by NAIPs determines inflammasome specificity[J]. Nature，2011，477(7366): 592-595.

[12]Motta V，Soares F，Sun T,etal. NOD-like receptors: versatile cytosolic sentinels[J]. Physiol Rev，2015，95(1): 149-178.

[13]Ydens E，Demon D，Lornet G,etal. Nlrp6 promotes recovery after peripheral nerve injury independently of inflammasomes[J]. J Neuroinflammation，2015，12: 143.

[14]Ataide MA，Andrade WA，Zamboni DS,etal. Malaria-induced NLRP12/NLRP3-dependent caspase-1 activation mediates inflammation and hypersensitivity to bacterial superinfection[J]. PLoS Pathog，2014，10(1): e1003885.

[15]Plato A，Hardison SE，Brown GD. Pattern recognition receptors in antifungal immunity[J]. Semin Immunopathol，2015，37(2): 97-106.

[16]Kufer TA，Sansonetti PJ. NLR functions beyond pathogen recognition[J]. Nat Immunol，2011，12(2): 121-128.

[17]Kim YK，Shin J-S，Nahm MH. NOD-like receptors in infection, immunity, and diseases[J]. Yonsei Medical Journal，2016，57(1): 5.

[18]Moreira LO，Zamboni DS. NOD1 and NOD2 signaling in infection and inflammation[J]. Front Immunol，2012，3: 328.

[19]Abbott DW，Yang Y，Hutti JE,etal. Coordinated regulation of Toll-like receptor and NOD2 signaling by K63-linked polyubiquitin chains[J]. Mol Cell Biol，2007，27(17): 6012-6025.

[20]Patin EC，Jones AV，Thompson A,etal. IL-27 induced by selectCandidaspp. via TLR7/NOD2 signaling and IFN-beta production inhibits fungal clearance[J]. J Immunol，2016，197(1): 208-221.

[21]Wagener J，Malireddi RK，Lenardon MD,etal. Fungal chitin dampens inflammation through IL-10 induction mediated by NOD2 and TLR9 activation[J]. PLoS Pathog，2014，10(4): e1004050.

[22]Zhang Y，Wu J，Xin Z,etal.Aspergillusfumigatustriggers innate immune response via NOD1 signaling in human corneal epithelial cells[J]. Exp Eye Res，2014，127: 170-178.

[23]Wu J，Zhang Y，Xin Z,etal. The crosstalk between TLR2 and NOD2 inAspergillusfumigatuskeratitis[J]. Mol Immunol，2015，64(2): 235-243.

[24]Yuan F，Kolb R，Pandey G,etal. Involvement of the NLRC4-inflammasome in diabetic nephropathy[J]. PLoS One，2016，11(10): e0164135.

[25]Tomalka J，Ganesan S，Azodi E,etal. A novel role for the NLRC4 inflammasome in mucosal defenses against the fungal pathogenCandidaalbicans[J]. PLoS Pathog，2011，7(12): e1002379.

[26]Lage SL，Longo C，Branco LM,etal. Emerging concepts about NAIP/NLRC4 inflammasomes[J]. Front Immunol，2014，5: 309.

[27]Latz E，Xiao TS，Stutz A. Activation and regulation of the inflammasomes[J]. Nat Rev Immunol，2013，13(6): 397-411.

[28]Kinoshita T，Imamura R，Kushiyama H,etal. NLRP3 mediates NF-kappaB activation and cytokine induction in microbially induced and sterile inflammation[J]. PLoS One，2015，10(3): e0119179.

[29]Rajamaki K，Mayranpaa MI，Risco A,etal. p38delta MAPK: A novel regulator of NLRP3 inflammasome activation with increased expression in coronary atherogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2016，36(9): 1937-1946.

[30]Okada M，Matsuzawa A，Yoshimura A,etal. The lysosome rupture-activated TAK1-JNK pathway regulates NLRP3 inflammasome activation[J]. J Biol Chem，2014，289(47): 32926-32936.

[31]Ketelut-Carneiro N，Silva GK，Rocha FA,etal. IL-18 triggered by the Nlrp3 inflammasome induces host innate resistance in a pulmonary model of fungal infection[J]. J Immunol，2015，194(9): 4507-4517.

[32]Joly S，Ma N，Sadler JJ,etal. Cutting edge:Candidaalbicanshyphae formation triggers activation of the Nlrp3 inflammasome[J]. J Immunol，2009，183(6): 3578-3581.

[33]Bruno VM，Shetty AC，Yano J,etal. Transcriptomic analysis of vulvovaginal candidiasis identifies a role for the NLRP3 inflammasome[J]. MBio，2015，6(2): e00182-15.

[34]Said-Sadier N，Padilla E，Langsley G,etal.Aspergillusfumigatusstimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase[J]. PLoS One，2010，5(4): e10008.

[35]Damm A，Lautz K，Kufer TA. Roles of NLRP10 in innate and adaptive immunity[J]. Microbes Infect，2013，15(6-7): 516-523.

[36]Joly S，Eisenbarth SC，Olivier AK,etal. Cutting edge: Nlrp10 is essential for protective antifungal adaptive immunity againstCandidaalbicans[J]. J Immunol，2012，189(10): 4713-4717.

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.13

国家自然科学基金(81572052);江苏省自然科学基金(BK20151178)；常州市医学领军人才项目(20101368)。

彭阳，1992年生，女，硕士研究生，主要从事临床微生物与免疫研究。

史伟峰，主任技师，副教授，硕士研究生导师，E-mail：swf67113@163.com。

R446.5；R446.6

A

2017-02-14)