石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究

哈 婧，王娇娇，赵帆帆，李丽丽，李建晨,段志清

(1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省药物分子化学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，河北石家庄 050018；3.河北医科大学第一医院，河北石家庄 050051)

石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究

哈 婧1,2，王娇娇1，赵帆帆1，李丽丽1，李建晨1,2,段志清3

(1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省药物分子化学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，河北石家庄 050018；3.河北医科大学第一医院，河北石家庄 050051)

为建立石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱的测定方法，采用Inertsil®ODS-2C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为265nm，柱温为30 ℃，流动相为甲醇-0.5%(体积分数)甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A对10个批次的石韦配方颗粒进行了相似度评价，并对其特征色谱峰峰面积进行了聚类分析。通过与标准品对比，确证了其中的2个色谱峰；通过多点校正及自动匹配，分析确定了9个特征峰；10批石韦配方颗粒的特征图谱相似度均大于0.85，通过聚类分析可将样品分为3类。该方法准确可靠，重复性好，可用于石韦配方颗粒的质量控制。

色谱分析；中药化学；石韦配方颗粒；特征图谱；质量控制

石韦为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosia sheareri(Bak.)Ching、石韦Pyrrosia lingua(Thunb.)Farwell或有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching的干燥叶，具有利尿通淋、清肺止咳、凉血止血等功效[1]。现代药理学研究表明，石韦具有镇咳祛痰[2-3]、降血糖[4-5]、抗病毒[6]、增强免疫力[7-8]、增加白细胞[9-10]、抑菌等作用。植物化学研究表明，石韦中主要含有有机酸、黄酮类、三萜类、呫酮类、甾体及挥发油成分[11]。

几千年来，汤剂是中药最常用的剂型。传统中药汤剂对煎药用具、用水、火候、时间、特殊煎煮方法等都有严格的要求[12-16]。随着现代社会的发展、科技水平的提高，中药汤剂已不能满足现代人快节奏的生活方式，中药配方颗粒[17-24]应运而生。中药配方颗粒避免了繁琐复杂的煎煮工序，便于服用、贮存、携带，且安全卫生。目前石韦配方颗粒的质量控制多集中在性状、粒度、水分、溶化性、浸出物以及含量测定方面，缺少行之有效的反映其药效物质基础特征的质量控制方法。有文献报道采用HPLC对石韦配方颗粒中的绿原酸、咖啡酸及芒果苷进行含量测定[25]，但未见其关于HPLC-DAD特征图谱的报道。中药特征图谱[15,26]是一种综合的、可量化的鉴定手段，可用于鉴别中药配方颗粒质量的真实性、优良性和稳定性，能较全面地反映其化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。本实验采用HPLC-DAD建立石韦配方颗粒的特征图谱，综合运用相似度分析和聚类分析方法对石韦配方颗粒进行分析，为全面严格控制石韦配方颗粒的质量提供有效的方法和科学依据。

1 材 料

1.1 仪器与试剂

LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津公司提供)，包括LC-10ATVP色谱泵、SPD-M10AVPDAD检测器、SIL-10ADVP自动进样器、CLASS-VP色谱工作站；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司提供)；AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司提供)；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司提供)；药典筛(新乡市同心机械有限责任公司提供)。

甲醇(色谱纯，瑞典欧普森公司提供)；水(杭州娃哈哈集团有限公司提供)；其他试剂为分析纯。绿原酸(中国药品生物制品检定所提供，批号为110753-201314)，芦丁(中国食品药品检定研究院提供，批号为100080-201408)。

1.2 样品

石韦配方颗粒由10批石韦药材经提取、浓缩、干燥及成型工艺制得。10批石韦药材均来自河北安国东方药城，经河北省药品检验研究院段吉平老师鉴定为水龙骨科植物石韦，样品来源为贵州(SW-001，SW-002，SW-003，SW-004)、江西(SW-005，SW-006，SW-007，SW-008)、河南(SW-009，SW-010)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品5.0mg，精密称定，置于棕色量瓶中，用50%(体积分数，下同)甲醇溶解，配制成含绿原酸0.100 0g/L的对照品溶液。

取芦丁对照品5.0mg，精密称定，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解，配制成含绿原酸0.100 0g/L的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取石韦配方颗粒粉末约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声(250W，40kHz)处理45min，放冷，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，制得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil®ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇(B)-0.5%甲酸(A)，洗脱梯度：0～15min，11%～20%B；15～40min，20%B；40～55min，20%～38%B；55～80min，38%B；80～115min，38%～90%B；115～130min，90%～11%B；流速1.0mL/min；柱温30 ℃；检测波长为265nm；进样量为10μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法制备供试品溶液，连续进样6次，将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，以色谱峰8为参照，计算其他峰的相对峰面积，见表1。由表1结果可知，相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该仪器的精密度良好。

表1 精密度试验结果(相对峰面积)

2.4.2 重复性

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法平行制备6份供试品溶液，梯度洗脱，记录色谱图。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，并以色谱峰8为参照，计算主要色谱峰的相对峰面积，见表2。由表2结果可知，各主要色谱峰相对峰面积的RSD值小于3%，说明方法的重复性良好。

表2 重复性试验结果(相对峰面积)

2.4.3 稳定性

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法制备供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，15，18，24h梯度洗脱，记录色谱图。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，并以色谱峰8为参照，计算主要色谱峰的相对峰面积，见表3，由表3结果可知，主要色谱峰相对峰面积的RSD值小于3%，说明样品溶液在24h内的稳定性良好。

表3 稳定性试验结果(相对峰面积)

2.5 石韦配方颗粒特征图谱的建立与分析

2.5.1 石韦配方颗粒特征图谱的建立

按上述方法制备10批样品的供试品溶液，梯度洗脱，得到10批次石韦配方颗粒HPLC特征图谱，见图1。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，得到11个共有峰，共有峰的总面积占总峰面积的90%以上，因此确定该11个色谱峰为石韦配方颗粒的特征图谱共有峰。

高血压是比较多见的一种慢性疾病,以老年群体为主,合并多种疾病。高血压患者的心肾脑肝等器官均会受到损伤,引起各种脏器的衰竭。患者血流动力学出现变化,血循环受到阻力,左心室出现代偿性肥厚,引起心衰,危急患者的生命安全,需要尽早的采取治疗措施。冠脉造影、心脏彩超是对高血压左室肥厚伴左心衰竭进行诊断的方式,心电图对早期的症状难以检测,冠脉造影费用高,有放射性,所以心脏彩超是常用的诊断方式。

2.5.2 参照峰及特征峰的确认

在10批次样品溶液的特征图谱中，峰8化学性质稳定，峰形佳，与其他峰分离良好，因此将其定为参照峰。通过与对照品图谱进行比对(见图2)，共确认了2个色谱峰，8号色谱峰为绿原酸、11号色谱峰为芦丁。

图1 10批石韦配方颗粒特征图谱
Fig.1 Characteristic chromatograms of 10 batches of Pyrrosia leaf formula granules

图2 石韦配方颗粒特征图谱
Fig.2 Characteristic chromatograms of Pyrrosia leaf formula granules

将10批石韦配方颗粒的特征图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A进行色谱峰匹配，获得的共有峰有11个，以所有共有峰作为特征峰评价石韦配方颗粒的真伪有可能造成误判。综合分析不同批次样品中各共有峰的峰面积及分离度，选定其中的2，3，4，5，6，8，9，10和11号色谱峰为石韦药材的特征峰，这9个特征峰具有良好的保留重现性。结果见表4。

表4 10批石韦配方颗粒特征图谱特征峰的相对峰面积

2.5.3 特征图谱相似度评价

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A软件，对10批石韦配方颗粒特征图谱进行数据处理，结果见表5。由表5可以看出，S7和S10的相似度小于0.9，其他批次石韦配方颗粒的相似度均大于0.9。

表5 10批石韦配方颗粒特征图谱相似度结果

注：R为参照图谱。

2.5.4 聚类分析

采用SPSS19.0统计分析软件，对10批石韦配方颗粒的特征图谱进行聚类分析。以9个特征峰峰面积为变量，进行标准差为1的标准化处理，选择离差平方和法(Ward’smethod)为聚类方法，欧式距离法(Euclideandistans)为测量距离法，对数据进行聚类分析。系统聚类分析将样品分成了3部分，见图3。第1部分包括S1，S2，S4和S5；第2部分包括S7和S10；第3部分包括S3，S6，S8和S9。聚类分析结果与相似度评价结果一致，2种方法相互印证，表明利用系统聚类分析可以更好地对数据进行分类。

图3 聚类分析树状图
Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

3 讨 论

通过查阅资料可知，绿原酸和芦丁的最大紫外吸收波长为326nm和358nm。综合考虑石韦中的各化学成分，采用光电二极管阵列检测器(DAD)对样品进行190～400nm的全波长扫描，对不同波长下的色谱图中各类成分的出峰情况、峰形大小、吸收峰的数量及强弱进行对比分析，结果发现在265nm波长下检测时石韦中各化学成分可以很好地表达出来。因此选择265nm为检测波长。

本实验考察了3个不同的流动相系统，即乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸和甲醇-0.5%甲酸系统。结果发现，甲醇系统明显比乙腈系统出峰个数多且基线平稳，故本实验最终选择甲醇-0.5%甲酸系统。同时对柱温(25，30，35 ℃)进行了考察，由结果可知，柱温25 ℃时可获得最佳的分析效果，故最终确定了实验所需的色谱条件。

采用相似度对石韦配方颗粒的10批样品进行分析，结果表明，除批号S7和S10之外，其他8批样品的相似度系数均大于0.9。系统聚类分析的结果与相似度评价结果基本吻合，说明不同批次石韦配方颗粒的化学组成存在一定的差异。经河北省药品检验研究院段吉平老师鉴定，S7和S10中混杂着不同程度的有柄石韦和大叶石韦，与所测结果一致。本实验10批石韦配方颗粒均具有所标示的特征峰，说明建立的石韦配方颗粒特征图谱具有可行性。该方法专属性强、操作简便、稳定易行，为控制和评价石韦配方颗粒的内在质量提供了科学依据。

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Study of HPLC-DAD characteristic chromatogram ofPyrrosia leaf formula granules

HAJing1,2,WANGJiaojiao1,ZHAOFanfan1,LILili1,LIJianchen1,2,DUANZhiqing3

(1.SchoolofChemicalandPharmaceuticalEngineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBase-KeyLaboratoryofMolecularChemistryforDrugofHebeiProvince,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 3.TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050051,China)

ThedetectionmethodofcharacteristicchromatogramofPyrrosialeafFormulagranulesbyHPLC-DADisestablished.TheanalysisisperformedonaInertsil®ODS-2C18column(4.6mm×250mm,5μm)withagradientmobilephaseofmethanol-0.5%formicacidataflowrateof1.0mL/min.Thedetectionwavelengthis265nm,thecolumntemperatureis30 ℃,andtheinjectionis10μL.TheSimilarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version2012A)isusedforthe10batchesofPyrrosialeafformulagranulesqualityassessment,andclusteranalysisisobtainedbasedoncharacteristicpeaksindetectedsamples.Twopeaksareconfirmedbycomparisonwiththechromatogramsofthestandardsubstances.Ninecharacteristicpeaksarefoundthroughmultipointreviseandthesimilarityevaluationsystem.Similaritiesof10batchesofPyrrosialeafformulagranulesareallmorethan0.85andtheanalyzedsamplesaregeographicallyclassifiedintothreeclasses.Themethodhasgoodcharacteristicsandspecificityofaccuracy,reliability,andrepeatability,andcanbeusedforthequalitycontrolofPyrrosialeafformulagranules.

chromatographicanalysis；Chinesemedicinechemistry；Pyrrosialeafformulagranules；characteristicchromatogram；qualitycontrol

1008-1542(2017)01-0039-07

10.7535/hbkd.2017yx01007

2016-07-23；

2016-09-30；责任编辑：张士莹

河北省食品药品监督管理局科技项目(ZD2015025)

哈 婧(1970—)，女，河北石家庄人，教授，博士，主要从事药物分离与分析方面的研究。

E-mail：hajing02@163.com

R

A

哈 婧, 王娇娇，赵帆帆，等.石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究[J].河北科技大学学报,2017,38(1):39-45.HAJing,WANGJiaojiao,ZHAOFanfan,etal.StudyofHPLC-DADcharacteristicchromatogramofPyrrosialeafformulagranules[J].JournalofHebeiUniversityofScienceandTechnology,2017,38(1):39-45.