正交设计优化平菇下脚料中麦角硫因的提取工艺

薛天凯，赵艳敏，林纪伟，刘岱琳，刘成航

（1.天津中医药大学，天津300193；2.武警后勤学院，天津300309；3.天津市河西区卫生监督所，天津300211；4.天津市科曼思特医药科技发展有限公司，天津300457）

正交设计优化平菇下脚料中麦角硫因的提取工艺

薛天凯1，2，赵艳敏1，2，林纪伟3，刘岱琳2，*，刘成航4

（1.天津中医药大学，天津300193；2.武警后勤学院，天津300309；3.天津市河西区卫生监督所，天津300211；4.天津市科曼思特医药科技发展有限公司，天津300457）

利用正交试验优化平菇下脚料中麦角硫因的回流提取工艺。通过高效液相色谱法，Kromasil 100-5NH2柱（250mm× 4.60mm，5μm），流动相乙腈-5mmol/L醋酸铵（80∶20，体积比），254nm下进行检测，建立麦角硫因的含量测定方法，以平菇下脚料中麦角硫因的含量及得率为评价指标。在单因素试验的基础上采用正交设计方法L9（34）考察提取时间、提取次数和料液比对麦角硫因提取效果的影响。结果表明平菇下脚料中麦角硫因的最佳提取工艺条件为：提取溶剂10%乙醇，料液比1∶6（g/mL），提取时间为2h，提取2次。通过验证试验，麦角硫因的总提取率可达87.45%，含量可达0.5%。

平菇下脚料；麦角硫因；正交试验；提取工艺

麦角硫因（巯基组氨酸三甲基内盐，ergothioneine，EGT）是1909年首次在麦角菌（Claviceps purpurea）中发现的一种天然稀有的手性氨基酸[1]。这种氨基酸是人体自身不能合成的，只能通过其转运蛋白OCTN1从饮食中摄取，且在特定的人体组织和细胞中富集。麦角硫因被认为是一种与细胞质醇及谷胱甘肽类似的天然的细胞内抗氧化剂，具有较强的抗氧化性，能够维持人体红细胞的功能并在保护其免受氧化损伤方面起着重要作用[2]，此外还具有防止紫外线辐射损伤[3-4]等多种生物活性，因此在化妆品、功能食品和膳食补充剂等方面呈现出良好的应用前景而备受学者的关注。麦角硫因这种天然稀有氨基酸在大多数生物体中含量都较低，我们课题组前期对来自全国各地的二十余种蘑菇菌种中麦角硫因的含量进行了调查[5-6]，其中榛蘑的菌伞中含量最高，可以达到0.2%，此外金针菇、鸡腿菇、白玉菇、口蘑和平菇的含量都大于0.02%；但是这些蘑菇的价格高，麦角硫因的含量也较低，如果选取其作为原料进行天然麦角硫因的提取，成本过高，将限制麦角硫因产品的产业化和未来的应用。

目前我国已经成为世界食用菌生产第一大国，栽培面积大，总产量高[7-8]。天津地区近年来也加大蘑菇种植产业的扶植力度，在西青区和蓟县地区已经形成了蘑菇种植产业主要集中区，并建成了多个大型的食用菌的农业产业化示范园区，生产双孢菇、金针菇、平菇和白灵菇等多个品种，目前每个蘑菇种植基地都可以达到年产鲜菇上万吨，有的地区单品年产值已经突破亿元。在蘑菇产品的采收加工过程中会有大批量的下脚料产生，这也是可以进行充分利用的蘑菇资源。基于资源循环利用的原则，我们选取了产量较大，蘑菇子实体大，下脚料相对较多且麦角硫因含量适中的平菇下脚料作为原料，利用单因素考察和正交试验相结合，优化平菇下脚料中麦角硫因的提取工艺，降低生产成本，显著提高生产效率，为产业化生产天然的麦角硫因提取物提供数据支撑，研究结果也将促进平菇下脚料的综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

平菇下脚料：购自天津市赵沽里农贸市场，样品标本冻干后存放于武警后勤学院生药学与药剂学教研室。麦角硫因标准品（含量98%）：天津市科曼思特医药科技发展有限公司；甲醇、乙腈：色谱纯；冰醋酸、氨水、乙酸铵：试剂级；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪（泵型号LC-20AT型、紫外检测器SPD-M20A、CTO-20柱温箱）：日本Shimadzu公司；MT5百万分之一电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-2数字显示恒温水浴锅：常州市国华仪器有限公司；SHB-111循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；EYEL4型旋转蒸发仪：上海爱朗公司；KQ5200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DHG-9000A型电热恒温鼓风干燥箱：上海益恒实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 测定方法

1.2.1.1 色谱分析条件[5]

色谱柱：Kromasil100-5NH2柱（250mm×4.60mm，5μm）；流动相：乙腈-5mmol/L醋酸铵（80∶20，体积比）；流速：1.0mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.2.1.2 对照品溶液配制

精密称取麦角硫因对照品1.58mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得麦角硫因对照品溶液（0.158mg/mL）。分别取上述对照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为对照品溶液，置于冰箱4℃保存备用。

1.2.1.3 供试品溶液配制

精密称取粉碎后的平菇下脚料样品15 g于250mL容量瓶中，加入90mL蒸馏水，精密称重后，于100℃下回流提取2 h，冷却至室温，用蒸馏水补齐重量后，摇匀，取2mL过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液，置于冰箱4℃保存备用。

1.2.1.4 麦角硫因标准曲线的绘制

分别取上述对照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后进行HPLC测定。以标准品峰面积Y为纵坐标，麦角硫因的质量浓度X（mg/mL）为横坐标进行线性回归方程计算，获取标准曲线。

1.2.1.5 样品水分含量测定

精密称取剪切成约0.5 cm×0.5 cm的平菇下脚料样品各2.5 g，平铺于干燥恒重的扁形称量瓶中，精密称定，在100℃～105℃干燥5 h。移置干燥器中，冷却30min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，冷却称重，至连续2次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算样品中的含水量（%），平行3次试验，确定原料中的水分，便于后续检测提取工艺时计算收率。

1.2.2 平菇下脚料中麦角硫因的单因素提取工艺考察

通过预试验，确定溶剂回流提取为最优的提取方法，并在单因素试验的基础上，选取4个因素各较优的3个水平进行正交试验，采用L9（34）设计进行正交试验获取最佳工艺参数。

1.3 数据处理

采用DPS数据处理软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照1.2.1.4项下的方法获取了麦角硫因的标准曲线方程为Y=4.86×107X+368 952，R2=0.999 9，在浓度0.008mg/mL～0.158mg/mL范围内，线性关系良好。对照品及平菇下脚料样品的色谱图如图1所示。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

精密吸取样品溶液20μL重复进样5次，测定色谱峰面积，计算RSD值，结果RSD=0.69%，表明试验仪器精密度良好。

图1 标准品（A）和平菇下脚料样品（B）的HPLC图谱Fig.1 Chromatograms of reference substance（A）and sample（B）

2.2.2 重现性试验

精密称取平菇下脚料样品5份，每份15 g，按1.2.1.3项下方法制备待测溶液，按1.2.1.1项下方法测定麦角硫因的峰面积，计算RSD=1.42%，表明该方法重现性良好。

2.2.3 稳定性试验

分别于0、4、8、12、24 h精密吸取处理后的平菇下脚料提取液样品溶液20μL进样，测定色谱峰面积，计算RSD为1.62%，结果表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.4 加样回收试验

精密称取已知麦角硫因含量的平菇下脚料样品15 g，分别加入相当于样品中麦角硫因含量的80%、100%、120%的对照品溶液，按1.2.1.3项下方法制备待测溶液，按1.2.1.1项下方法测定麦角硫因的峰面积，结果如表1所示。

表1 麦角硫因加样回收率结果（n=3）Table1 The addition recovery of ergothioneine（n=3）

由表1可知，加样回收率均在95%～105%之间，表明本方法的加样回收率良好，符合要求。平均回收率为100.07%，RSD值为1.53%，回收率良好。

2.2.5 样品水分含量测定[7]

按照1.2.1.5项下方法平行测定了5批平菇下脚料中的水分含量，其平均值为88.12%，RSD值为1.29%。

2.2.6 样品中麦角硫因的含量测定[7]

按照1.2.1.3项下方法提取平菇下脚料提取物，按照1.2.1.1项下方法测定各供试品中麦角硫因的峰面积，代入标准曲线，计算样品溶液中麦角硫因的浓度，并利用公式计算各样品的含量，每个样品平行试验3次。

式中：C为供试品中麦角硫因的浓度，mg/mL；V为样品的体积，mL；M为各样品的质量，g；W为各个样品的水分含量，%。

式中：C1为供试品溶液中麦角硫因的浓度，mg/ mL；V1为样品的体积，mL；M为各样品的质量，g；W为各个样品的水分含量，%；A为平菇下脚料中麦角硫因的含量，%。

2.3 单因素试验

2.3.1 不同提取溶剂对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响

按照1.2.1.3项下方法，选择料液比1∶6（g/mL），回流提取时间2 h，提取次数为1次，按照1.2.1.1项下方法进行检测，分别考察蒸馏水，10%乙醇水溶液，20%乙醇水溶液，30%乙醇水溶液对麦角硫因提取效果的影响，结果如图2所示。

图2 不同浓度的乙醇水溶液对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响Fig.2 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different concentrations of ethanol

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，麦角硫因的提取率显著下降，说明麦角硫因并不适于乙醇溶液进行提取。因此提取溶液确定为水溶液。

2.3.2 pH值对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响

按照1.2.1.3项下方法，选择料液比1∶6（g/mL），回流提取时间2h，提取次数为1次，按照1.2.1.1项下方法进行检测，分别考察pH值在4、5、6、7、8、9、10时纯净水溶液对麦角硫因提取效果的影响，结果如图3所示。

图3 不同pH值对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响Fig.3 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different pH

由图3可知，pH值对提取效果影响较大。当水溶液的pH值＜7时，麦角硫因的提取效率较低，pH值为8时，麦角硫因的提取率最高，为81.2%，随着pH值逐渐增加，当pH值为10时，提取率显著下降。因此确定pH值为8的弱碱性水溶液作为提取溶液。

2.3.3 不同料液比对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响

按照1.2.1.3项下方法，选择pH值为8的水溶液作为提取溶剂，回流提取时间2 h，提取次数为1次，按照1.2.1.1项下方法进行检测，分别考察料液比为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）时对麦角硫因提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 不同料液比对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响Fig.4 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different material liquid ratio

由图4可知，料液比不同对麦角硫因的提取率存在一定的影响。提取液中溶剂用量少时麦角硫因提取不完全，提取溶剂用量增大，会提高麦角硫因的提取率。但是提取溶剂继续增加，对提取效果的帮助并不大，而且会造成溶剂浪费，增加后续溶剂回收成本。所以选取料液比为1∶6（g/mL）。

2.3.4 提取时间对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响

按照1.2.1.3项下方法，选择pH值为8的水溶液作为提取溶剂，料液比1∶6（g/mL），提取次数为1次，按照1.2.1.1项下方法进行检测，分别考察提取时间为1、2、3、4 h时对麦角硫因提取效果的影响，结果如图5所示。

图5 不同提取时间对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响Fig.5 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different extract time

由图5可知，麦角硫因的提前率随提取时间的增加先增后降。说明适宜的时间可以促进提取率的增加，当提取时间过长会影响麦角硫因的稳定性，从而导致提取率降低，因此选取提取时间为2 h。

2.3.5 提取次数对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响

按照1.2.1.3项下方法，选择pH值为8的水溶液作为提取溶剂，料液比1∶6（g/mL），回流提取2 h，按照1.2.1.1项下方法进行检测，分别考察提取次数为1次、2次、3次、4次时对麦角硫因提取效果的影响，结果如图6所示。

图6 不同提取次数对提取平菇下脚料中麦角硫因的影响Fig.6 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different extract times

由图6可知，提取次数对麦角硫因的提取率具有一定的影响，但是当提取次数达到2次之后，提取率增加非常平缓，因此确定提取次数为2次。

2.4 正交试验

根据单因素试验结果，选用L9（34）正交表，选取不同pH值的水溶液、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，以麦角硫因的含量为判断指标，对平菇下脚料中麦角硫因的提取工艺进行正交试验。各试验平行测定3次，取平均值。本正交试验应用SPSS17.0进行正交试验结果分析，以四因素三水平进行了正交试验，因素与水平、结果与分析以及方差分析结果分别如表2、表3、表4。

表2 正交试验L9（34）因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交试验结果Table3 Results and analysis of orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Table4 Variance analysis results of orthogonal test

由正交试验结果可知，根据R值的差异，对平菇下脚料中麦角硫因提取率的影响因素的主次顺序为D（提取次数）>B（料液比）>A（提取溶剂）>C（提取时间），根据试验结果确定的提取方法为D1B1A2C2，即最佳提取条件为pH=8的纯净水回流提取，料液比为1∶6（g/ mL），提取时间为2 h，提取次数为2次。

2.5 验证试验

按2.4项下方法优选出的最佳条件进行3次验证试验，麦角硫因的提取率分别为86.31%、87.13%、88.91%，平均值为87.45%，RSD为1.52%；麦角硫因的含量分别为：0.52%、0.51%、0.52%，平均值为0.517%，RSD为1.12%。与正交试验1号所得含量0.53%相比，由最佳提取条件所得的提取率高于单因素水平获得的产品提取率，且通过最佳工艺的提取，获得的提取物中麦角硫因的含量也相对较高，因此综合分析将D1B1A2C2确定为最佳提取工艺。

3 结论

本研究采用加热回流提取法对平菇下脚料中麦角硫因的提取工艺进行优化。分别以麦角硫因的提取率和麦角硫因的含量为指标，采用单因素试验和正交试验方法，考察了提取溶剂、料液比、提取时间和提取次数等因素对麦角硫因提取工艺的影响，最终确定平菇下脚料中麦角硫因的最优工艺为：提取溶剂为弱碱性水溶液（pH=8），料液比1∶6（g/mL），提取时间为2 h，提取2次。通过验证试验发现该提取工艺的提取效率大幅度增加，且提取率达到了87.45%。该提取工艺具有提取率高、操作简便等优点，为麦角硫因提取物的工业化大生产提供了科学依据与参考，同时也促进了平菇下脚料的综合利用，提升农产品废弃物的附加值，促进地区循环经济发展。

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Optimization of the Extraction Technique of Ergothioneine from Mushroom Scraps by Orthogonal Method

XUE Tian-kai1，2，ZHAO Yan-min2，LIN Ji-wei3，LIU Dai-lin2，*，LIU Cheng-hang4
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Logistics University of People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China；3.Tianjin Hexi District Health Supervision Institute，Tianjin 300211，China；4.Tianjin Chroma-standard Medical Science&Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

mushroom scraps；ergothioneine；orthogonal experiment；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.010

2016-07-27

天津市科技支撑项目（12ZCZDNC01500）

薛天凯（1991—），男（汉），硕士，研究方向：天然产物活性成分研究。

*通信作者：刘岱琳（1973—），女（汉），教授，研究方向：天然产物活性成分研究。

Abstract：The extraction technique for ergothioneine from mushroom scraps of Pleurotus ostreatus（Fr.）Kummer was optimized.The analysis were performed on Kromasil 100-5NH2column with mobile phase consisted of acetonitrile-5mmol/L ammonium acetate solution（80∶20，volume ratio）.The detected wavelength was set at 254 nm.The content and the extraction yield of ergothioneine were used as index to evaluate the technologies based on single factor test，in which three factors were considered the concentration of extraction time，extraction times and solid-liquid ratio by orthogonal design.The best extraction conditions were as follows：ethanol concentration of10%，twice，extraction time of two hours and ratio of liquid to solid of1∶6（g/mL）.The optimized extraction rate could reach 87.45%，the content of ergothioneine was 0.5%.