微生物絮凝剂γ-聚谷氨酸的生产及应用研究进展

邵 颖，赵彩凤，邵 赛，张乐平

（湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所，湖南省农业生物辐照工程技术研究中心，生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410125）

微生物絮凝剂γ-聚谷氨酸的生产及应用研究进展

邵 颖，赵彩凤，邵 赛，张乐平

（湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所，湖南省农业生物辐照工程技术研究中心，生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410125）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通过肽键结合形成的一种多肽高分子，具有良好的水溶性、生物相容性、水解性、生物可降解性、无毒等优良特性。文章综述了微生物合成γ-PGA生产工艺，如生产菌株、培养基优化、发酵工艺和固定化技术等，介绍了γ-PGA在废水处理方面的应用，并指出了其发展方向。

γ-聚谷氨酸；生物合成；废水；应用；综述

微生物絮凝剂（Microbial flocculants，简称MBF）是利用生物技术，从微生物菌体或其分泌物中提取、纯化而获得的一种安全、高效，且能生物降解的新型水处理絮凝剂[1]。MBF可以克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的安全和环境污染方面的缺陷，易于生物降解、无毒、无二次污染。生物絮凝剂已应用于纸浆废水、染料废水处理、污泥脱水及发酵菌体去除[1-2]等领域。MBF活性成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素、DNA以及具有絮凝活性的菌体等[3]。目前，MBF存在价格昂贵、絮凝活性不高、投加量大等缺点，其工业化应用不多。

γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamic acid，γ-PGA）是一种由芽孢杆菌（主要为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）合成的细胞外水溶性氨基酸聚合物。γ-PGA由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基形成肽键之后生成的线型同聚酰胺，分子量一般在100～1 000 kDa[4]。γ-PGA分子中每个重复单元的α碳原子上连有一个羧基，可在分子内和分子间形成氢键。γ-PGA是一种阴离子聚合氨基酸，其二级结构在不同pH和离子强度下呈现不同构象[5]。γ-PGA分子中富含-COOH、-CO-、-NH-等多种活性基团，电荷密度高，分子量较大且呈线性，具有良好的絮凝活性。目前，高生产成本（高原料成本与复杂的分离纯化工艺），低产量是制约γ-PGA工业化应用的重要因素。

γ-PGA具有优良的成膜性、成纤维性、阻氧性、粘结性、可塑性、吸水性和生物可降解性等特性，使其具有成膜、增稠、乳化、凝胶、保温、助溶、粘结和缓释等功能[4,6]，在水处理、医药、食品、农业、化妆品等领域具有广阔的应用前景。本文主要对微生物絮凝剂γ-聚谷氨酸的发酵生产工艺及在废水处理方面的应用、国内外发展动态及研究现状进行综述。

1 γ-PGA的发酵生产工艺

1.1 γ-PGA生产菌株

γ-PGA生产菌株主要为芽孢杆菌。根据合成γ-PGA过程中是否需要谷氨酸将其分为谷氨酸依赖型和谷氨酸非依赖型γ-PGA生产菌。非依赖型γ-PGA生产菌由于培养基不需要提供谷氨酸，原料成本较低，但是γ-PGA产量一般较低（10 g/L左右）。谷氨酸依赖型γ-PGA生产菌产量较高（大于20 g/L），但原料成本较高[7-9]。

1.2 优化培养

碳源、金属离子、前体物质、微量元素、生物素等对不同菌株的产量存在很大差异。培养基组成和含量，温度、pH、供氧等发酵条件对γ-PGA产量和分子量大小和分布影响较大。

多篇报道采用响应面法（RSM）或正交设计（PB设计）法对γ-PGA发酵培养基进行优化。Chen等[10]采用RSM对Bacillus subtilis CCTCC202048固态发酵生产γ-PGA培养基进行了优化，在最优发酵条件下，γ-PGA产量为4.7%（w/w）。Soliman等[11]采用PB设计对谷氨酸非依赖菌Bacillus sp. SBA-26培养基成分的15个变量进行优化，结果发现K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4和酪蛋白水解物是影响γ-PGA产量的主要组分，在优化培养基条件下，γ-PGA最大产量为33.5 g/L。Yong等[9]采用RSM优化B. amyloliquefaciens C1固态发酵培养基，γ-PGA最大产量达4.37%。Bajaj等[8]采用因子分析法、PB设计和RSM等多种方法对B. licheniformis NCIM 2324生产γ-PGA培养基进行了优化，产量从5.27 g/L提高到26.12 g/L。Shi等[9]采用RSM优化B. subtilis ZJU-7培养基组分，γ-PGA产量提高了1倍，达58.2 g/L。可见，通过统计法可以使γ-PGA产量不同程度提高，同时减少工作量。

1.3 发酵工艺

在高黏性产物好氧发酵生产过程中，提高溶氧和氧传质效率对于提高目标产物产量和生产速率非常关键。目前，提高溶氧的技术有微孔曝气技术、膜生物反应器等[12]。在γ-PGA生物发酵生产过程中，由于其高粘度特性，导致中后期发酵液粘度较大，严重影响混合、传氧和传质过程，进而影响γ-PGA产量、分子量大小和分子量分布等[13]。Bajaj等[14]研究表明，高转速和高通气量可促进B. licheniformis NCIM 2324生长，当搅拌转速低于750 r/min时，γ-PGA产量随转速增加而增大，当转速为750 r/min，通气量1 vvm时，γ-PGA最大产量为46.34 g/L。Cromwick等[8]研究了曝气和pH等因素对B. licheniformis ATCC 9945A分批发酵生产γ-PGA产量影响，结果表明，在最适pH 6.5条件下，搅拌速率从250 r/min提高到800 r/ min，曝气量从0.5 L/min增大到2.0 L/min，γ-PGA产量从6.3 g/L增加到23 g/L，尽管如此，局部溶氧限制仍不可避免。符爽等[15]采用离心式纤维床生物反应器（Centrifugal Fibrous-Bed Bioreactor，CFBB）生产γ-PGA，以强化传质及传氧过程，结果发现CFBB中发酵液的最高黏度为4 000 mPa·s，低于搅拌釜式发酵罐，低粘度有利于氧传质，可连续生产γ-PGA。

1.4 固定化菌生产γ-PGA

细胞固定化技术可以实现细胞的重复利用，有利于产品的分离纯化，简化后处理工艺，缩短生产周期，可实现连续或半连续生产，从而降低发酵成本。采用固定化细胞发酵，可以得到含菌量很少甚至不含菌体的发酵液。易于实现产物分离与发酵耦合，减少菌体分离成本，促进工业化应用[15]。在高粘性黄原胶、鲁兰多糖等胞外多糖发酵生产中，固定化细胞研究较多，这对高粘性的γ-PGA生产同样适用[16-17]。Hsu等[16]利用棉纤维固定化Xanthomonas campestris细胞生产黄原胶，产量为游离细胞的2倍。West等[17]利用壳聚糖微球固定化Aureobasidium pullulans ATCC 201253生产普鲁兰多糖，应用1%壳聚糖小球固定化菌株重复生产2批次，第2批次产量（5.0 g/L）为第1批次（3.1 g/L）的1.6倍。Zhang等[13]利用聚氨酯泡沫固定化X. campestris CGMCC 1.1781固态发酵生产黄原胶，黄原胶产量为42.62 g/L，约为深层通气发酵产量的2倍。在γ-PGA微生物合成研究中，关于细胞固定化报道较少。Berekaa等[18]研究了包埋法和吸附法固定化B. lichenniformis strain-R生产γ-PGA，结果表明吸附法优于包埋法，最适固定化载体为海绵。以海绵固定化细胞strain-R，在柱式滴流床反应器进行批次半连续生产γ-PGA，第3批次γ-PGA产量最大，为55.5 g/L，第4批次γ-PGA产量略微下降。

2 γ-PGA废水处理方面的应用

γ-PGA为线型聚阴离子高分子，具有水溶性聚羧酸的性质，有强吸水性和金属螯合性，可用作絮凝剂[19]。作为一种新型微生物絮凝剂，γ-PGA具有生物可降解性、水溶性、无毒和环境友好等优点，在水处理方面应用前景广阔[20]。

在γ-PGA絮凝活性研究方面，Yokio等[21]考察了Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金属离子作为γ-PGA助凝剂对高岭土悬浮液的絮凝活性影响，结果表明，Ca2+对γ-PGA助凝效果最佳，最适pH为4。Shih等[41]也考察了金属离子和pH对絮凝活性的影响，发现Ca2+为最佳助凝离子，最佳絮凝pH为中性。Bajaj等[23]采用响应面法对B. subtilis R 23生产的γ-PGA最佳絮凝条件进行了优化，在最佳条件下，絮凝活性达到最大30.32±1.4 1/OD。Wu等[3]对B. subtilis DYU1发酵产物（主要成分为γ-PGA）的絮凝性能进行了研究，对γ-PGA絮凝高岭土的机理进行了初步推测，但实验数据不充分。Taniguchi等[24]对γ-PGA进行了交联改性，并研究了其物理化学性能及其对高岭土的絮凝活性。采用改性γ-PGA和无机絮凝剂聚合氯化铝复配使用，絮凝活性显著提高。

在废水脱色方面，Inbaraj等[25]研究γ-PGA包裹的磁性纳米颗粒对亚甲基蓝染料吸附特性，最大吸附容量达78.67 mg/g。Inbaraj等[26]研究了γ-PGA对阳离子型染料碱性蓝9（BB9）和碱性品绿4（BG4）的吸附，饱和吸附量分别为352.76和293.32 mg/g。Deng等[2]利用Aspergillus parasiticus产生的絮凝剂对8种染料进行了处理，对活性蓝4和酸性黄25的处理效率分别达到了92.4%和92.9%。

工农业废水、城市生活污水及各种采矿废水均含有大量的金属离子，这些重金属通过食物链生物富集，严重威胁生物和人体健康。目前应用的废水处理方法分为化学法、物理法和生物法。利用微生物絮凝剂对废水中的重金属进行处理，是近年来研究的热点。在重金属去除方面，Mark等[27]研究发现，B. licheniformis ATCC 9945生产的γ-PGA对Cu2+有很强的吸附能力和吸附容量，可用于除去废水中的重金属离子，用于回收金属和减少环境污染等。徐虹等[28]研究发现γ-PGA能有效降低电镀废水中Cr3+、Ni2+等金属离子浓度。Inbaraj等[29]研究发现γ-PGA吸附汞（Ⅱ）为放热自发的反应，吸附动力学符合准二级，5 min吸附量可达80 mg/L。Yao等[30]应用Bacillus subtilis NX-2所产的γ-PGA吸附电镀废水中微量重金属离子，Cr（Ⅲ）从3.07 mg/L降至0.15 mg/L，Ni（Ⅱ）从9.46 mg/L降至1.01 mg/L，达到排放标准。

3 展 望

γ-PGA从原材料、生产过程和产品性能均能实现真正意义上的“绿色”，具有广阔的发展前景和巨大的开发潜力。然而，亟需解决的是如何降低生产成本和控制产物结构（L-/D-单体比例）、分子量等。根据国内外发展现状，笔者认为γ-PGA的研究方向将主要集中在以下两个方面[31]：一方面继续寻找能够利用廉价的原料高效高产γ-PGA的优良菌株，尤其是谷氨酸非依赖性合成菌，如采取与谷氨酸生产菌共混发酵法，或利用烟草叶肉细胞、谷氨酸棒杆菌作为宿主实现γ-PGA合成酶表达，降低生产成本；另一方面致力于对γ-PGA合成工艺及合成机制的探讨。发酵液粘度随γ-PGA浓度增加而增大。高粘性引起的传氧和传质限制是导致发酵产量低的重要影响因素之一。因此，高效、低能耗曝气方式的研究将有效的提高γ-PGA的产量。同时通过染色体融合、合成酶表面修饰、基因剪切等生物化学与分子生物学方面深入研究，结合基因和蛋白组数据库、模拟基因表达和酶系催化，实现γ-PGA的体外合成控制，为γ-PGA大规模生产和应用提供理论基础与技术支撑。

[1] Junyuan G，Cheng C. Removal of arsenite by a microbial bioflocculant produced from swine wastewater[J]. Chemosphere，2017，181：759-766.

[2] Deng S，Yu G，Ting Y P. Production of a bioflocculant by Aspergillus parasiticus and its application in dye removal[J]. Colloids Surf B Biointerfaces，2005，44（4）：179-86.

[3] Wu J Y，Ye H F. Characterization and flocculating properties of an extracellular biopolymer produced from a Bacillus subtilis DYU1 isolate[J]. Process Biochem，2007，42 （7）：1114-1123.

[4] Buescher J M，Margaritis A. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical, biomedical and food industries[J]. Crit Rev Biotechnol，2007，27 （1）：1-19.

[5] Gooding E A，Sharma S，Petty S A，et al. pH-dependent helix folding dynamics of poly-glutamic acid [J]. Chemical Physics，2013，422（18）：115-123.

[6] Pereira A E， Sandovalherrera I E，Zavalabetancourt S A，et al. γ-Polyglutamic acid/chitosan nanoparticles for the plant growth regulator gibberellic acid: Characterization and evaluation of biological activity[J]. Carbohydrate Polymers，2017，157：1862-1873.

[7] Yong X，Raza W，Yu G，et al. Optimization of the production of polygamma-glutamic acid by Bacillus amyloliquefaciens C1 in solid-state fermentation using dairy manure compost and monosodium glutamate production residues as basic substrates[J]. Bioresour Technol，2011，102 （16）：7548-7554.

[8] Bajaj I B，Lele S S，Singhal R S. A statistical approach to optimization of fermentative production of poly(gamma-glutamic acid) from Bacillus licheniformis NCIM 2324[J]. Bioresour Technol，2009，100 （2）：826-832.

[9] Feng S， Zhinan X，Peilin C. Optimization of γ-polyglutamic aicd production by Bacillus subtilis ZJU-7 using a surface-respone methodology[J]. Biotechnol Bioproc E，2006，11 (3)：251-257.

[10] Xiong C，Shouwen C，Ming S，et al. Medium optimization by response surface methodology for poly-gamma-glutamic acid production using dairy manure as the basis of a solid substrate[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2005，69 （4）：390-396.

[11] Soliman N A，Berekaa M M，Abdel-Fattah Y R. Polyglutamic acid (PGA) production by Bacillus sp. SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2005，69（3）：259-267.

[12] ZeeW L，Raha A R，Arbakariya B. A，et al. Biosynthesis of high molecular weight hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus using oxygen vector and optimum impeller tip speed [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，114（3）：286-291.

[13] Zhang Z G，Chen H Z. Xanthan production on polyurethane foam and its enhancement by air pressure pulsation[J]. Appl Biochem Biotechnol，2010，162 （8）：2244-2258.

[14] Bajaj I B，Singhal R S. Effect of aeration and agitation on synthesis of poly (γ-glutamic acid) in batch cultures of Bacillus licheniformis NCIM 2324[J]. Biotechnol Bioproc E，2010，15 (4)：635-640.

[15] 符 爽. 枯草芽孢杆菌ZJU-7发酵生产γ-聚谷氨酸的研究[D]. 浙江：浙江大学，2008.

[16] Hsu C H，Chu Y F，Aring-Soysal S，et al. Effects of surface characteristics and xanthan polymers on the immobilization of Xanthomonas campestris to fibrous matrices[J]. J Food Sci，2004，69（9）：E441-E448.

[17] West T P. Pullulan production by Aureobasidium pullulans cells immobilized in chitosan beads. Fungal pullulan production by immobilized cells[J]. Folia Microbiol (Praha)，2011，56 （4）：335-338.

[18] Berekaa M M，Aassar S A E，El-Sayed S M，et al. Production of polyγ-Glutamate (PGA) biopolymer by batch and semicontinuous cultures of immobilized Bacillus licheniformis strain-R[J]. Braz J Microbiol，2009，40 （4）：715-724.

[19] Kunioka M. Biodegradable water absorbent synthesized from bacterial poly (amino acid)s[J]. Macromol Biosci，2004，4（3）：324-329.

[20] Shih I L，Van Y T. The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications[J]. Biores Technol，2001，79（3）：207-225.

[21] Yokoi H，Arima T，Hirose J，et al. Flocculation properties of poly (γ-glutamic acid) produced by Bacillus subtilis[J]. J. Ferment. Bioeng，1996，82 （1）：84-87.

[22] Shih I L，Van Y T，Yeh L C，et al. Production of a biopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties[J]. Biores Technol，2001，78（3）：267-272.

[23] Bajaj I B，Singhal R S. Flocculation properties of poly (gamma-glutamic acid) produced from Bacillus subtilis Isolate[J]. Food Bioprocess Tech，2011，4（5）：745-752.

[24] Taniguchi M，Kato K，Matsui O，et al. Flocculating activity of crosslinked poly-gamma-glutamic acid against bentonite and Escherichia coli suspension pretreated with FeCl3 and its interaction with Fe3+[J]. J. Biosci Bioeng，2005，100（2）：207-211.

[25] Inbaraj B S，Chen B H. Dye adsorption characteristics of magnetite nanoparticles coated with a biopolymer poly(γ-glutamic acid)[J]. Bioresour Technol，2011，102（19）：8868-8876.

[26] Inbaraj B S，Chiu C P，Ho G H，et al. Removal of cationic dyes from aqueous solution using an anionic poly-gamma-glutamic acid-based adsorbent[J]. J Hazard Mater，2006，137（1）：226-34.

[27] Mark S S，Crusberg T C，Dacunda C M. A heavy metal biotrap for wastewater remediation using poly-gamma-glutamic acid[J]. Biotechnol Progr，2006，22（2）：523-531.

[28] 姚 俊，徐 虹. 生物絮凝剂γ-聚谷氨酸絮凝性能研究[J]. 生物加工过程，2004，2（1）：35-39.

[29] Inbaraj B S，Wang J S，Lu J F，et al. Adsorption of toxic mercury(II) by an extracellular biopolymer poly(gamma-glutamic acid) [J]. Bioresour Technol，2009，100（1）：200-207.

[30] Yao J，Xu H，Wang J，et al. Removal of Cr(III), Ni(II) and Cu(II) by poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis NX-2[J]. J Biomat Sci-Polym E，2007，18（2）：193-204.

[31] 曹名锋，金映虹，解 慧，等. γ-聚谷氨酸的微生物合成、相关基因及应用展望[J]. 微生物学通报，2011， 38（3）：388-395.

（责任编辑：夏亚男）

Research Progress on Production and Application of Bioflocculantγ-Polyglutamic Acid

SHAO Ying，ZHAO Cai-feng，SHAO Sai，ZHANG Le-ping
（1. Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding, Hunan Academy of Agriculture Sciences, Hunan province Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation, Hunan province Biological Irradiation Techonology Engineering Research Center, Changsha 410125, PRC）

γ-polyglutamic acid is a polypeptide composed of L-glutamic acid or D-glutamic acid by peptide bond formation. γ-PGA is a promising environmental friendly material with outstanding water solubility, biocompatibility, hydrolysis, biodegradability and nontoxic. This paper reviews the microbial synthesis of γ-PGA production processes, such as the production of strains, medium optimization, fermentation technology and immobilization technology. Meanwhile, it focuses on the application of γ-PGA in wastewater treatment, and points out the development direction in the future.

γ-polyglutamic acid; biosynthesis; wasterwater; application; review

X703.5

：A

：1006-060X（2017）08-0123-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.008.032

2017-06-06

湖南省农业生物辐照工程技术研究中心科学基金开放项目（2016KF002）；湖南省农业科学院科技创新项目（2016QN09）；湖南省环境保护厅科研课题（湘财建指〔2016〕59号）

邵 颖（1965-），女，湖南湘阴县人，副研究员，主要从事核辐射与环保新材料研究。

邵 赛