液相色谱串联质谱法同时测定动物血浆中21种霉菌毒素或其代谢物残留

王瑞国　苏晓鸥　王培龙　张维　薛岩　李玉

摘要建立了同时检测动物血浆中黄曲霉毒素B1等21种霉菌毒素或其代谢物残留的液相色谱串联质谱方法。动物血浆样品中加入0.1%甲酸乙腈溶液、NaCl和无水MgSO4进行萃取，无水MgSO4和C18，PSA，AAL对提取液进行脱水净化，经浓缩、复溶和离心后，再进行测定。采用反相C18色谱柱分离，以0.1%甲酸0.5 mmol/L 乙酸铵溶液和0.1%甲酸甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI）多反应监测离子模式（MRM）进行检测，基质标准曲线外标法进行定量分析，线性范围在0.05～100 ng/mL之间，方法的定量限为0.05～0.5 ng/mL。在高、中、低3个添加浓度水平下，21种霉菌毒素的平均回收率为62.0%～116.4%， 相对标准偏差小于19%。

关键词液相色谱串联质谱； 动物血浆； 霉菌毒素； 残留

1引 言

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌在生长过程中产生的次级有毒代谢产物[1]，目前已经确认化学结构的霉菌毒素达400多种[2]，这些霉菌毒素主要由曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）和麦角菌属（Claviceps）霉菌产生[3]。谷物、油料籽实以及由此加工的动物饲料特别易于被各种霉菌毒素污染，从而造成人或动物急性或慢性中毒反应[4]。研究显示，全球大约25%的农产品受到霉菌毒素污染，因此需要对其进行监测以控制食物链中的霉菌毒素[5]。世界卫生组织将霉菌毒素纳入食品安全体系重点监测内容[6]，中国对食品和饲料中黄曲霉毒素等重要毒素规定了最高限量标准[7～11]。评价人和动物霉菌毒素暴露水平一般采取分析食品、饲料中霉菌毒素含量的间接方法[12]。由于受到食品和饲料中霉菌毒素污染水平、加工方式、个体摄入和吸收代谢等多种因素影响，这种方法的评估结果可靠性比较差[13]。近年来，一些研究直接测定人和动物血液、尿液等生物样本中霉菌毒素或其代谢物， 反映霉菌毒素暴露水平及其体内的吸收代谢过程。例如，urner等[14]调查了英国34名成年人尿液中呕吐毒素及其葡萄糖醛苷酸结合物浓度范围为5.0～78.2 ng/mL，证实了葡萄糖醛苷酸化是呕吐毒素在人体内主要代谢途径。Cunha等[15]对13名葡萄牙志愿者尿液中呕吐毒素进行了检测，发现69%的志愿者尿液中检出呕吐毒素或其代谢物。Meky等[16]研究了小鼠恩镰孢菌素A连续暴露28天，其在血液、尿液和粪便中残留水平与暴露时间的动态变化。然而，这些方法只针对一种或一类结构相似的霉菌毒素进行检测，但饲料由于原料来源复杂多样，常被多种霉菌毒素污染[17]。因此，开发动物血浆中多种霉菌毒素同时检测方法具有十分重要的现实意义。

目前，已经有少量关于动物和人血液等生物样本中霉菌毒素检测方法的报道。这些方法主要有高效液相色谱法[18]、液相色谱串联质谱法[19～21]和气相色谱串联质谱法[22]，样品前处理方法采用了免疫亲和柱[18，19]或固相萃取[20～22]等技术，操作比较繁琐，检测费用高，一般难以做到多种霉菌毒素的同时测定。QuECERs方法（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）是近年发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。本研究应用液相色谱串联质谱技术，基于QuECERs原理开发了样品提取和净化方法，同时检测动物血浆中21种霉菌毒素及其代谢物，具有操作简单、快速、成本低、定量准确等特点，可用于动物霉菌毒素联合暴露评估及霉菌毒素毒代动力学研究。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Acquity超高效液相色谱仪、XEVO QS串联质谱仪（美国Waters公司）； RVC 218台式离心浓缩仪（德国CRIS公司）； 3K15高速冷冻离心机（美国Sigma公司）； D37520高速离心机（美国Kendro公司）； VXⅢ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）。

标准品及由标准品配制的混合标准溶液储备液（溶剂为乙腈）浓度信息见表1。乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）； 实验用水为MilliQ超纯水。混合标准溶液储备液于

2.2样品前处理

准确量取2.0 mL（精确至0.001 mL）猪血浆样品于50 mL塑料离心管中，向其中加入6 mL 0.1%甲酸乙腈溶液以沉淀蛋白，2000 r/min涡旋1 min，置于4℃冷藏20 min，再加入0.2 g NaCl和0.8 g无水MgSO4，2000 r/min涡旋1 min，8000 r/min离心5 min。静置片刻，量取上层溶液4 mL置于10 mL具塞塑料离心管中，加入无水MgSO4 600 mg， C18，PSA，AAL各100 mg， 2000 r/min涡旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液过0.22 μm尼龙微孔滤膜，精密量取滤液3 mL置于10 mL塑料离心管中，真空浓缩仪中60℃、1500 r/min抽干，用0.5 mL 0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）溶解残渣，13000 r/min离心5 min，取上清液置于进样小瓶中，供LCMS/MS测定。

2.3色谱和质谱条件

Acquity UPLC BERP18色谱柱（100 mm × 2.1mm，1.7 μm，美国Waters公司）； 柱温40℃，流速0.3 mL/min， 进样量3 μL。流动相A为0.1%甲酸0.5 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇。梯度洗脱： 0～2 min，95% A； 2～4 min，95%～80% A； 4～12 min，80%～5% A； 12～12.1 min，5%～1% A； 12.1～13 min，1% A； 13～13.5 min，1%～95% A； 13.5～14 min，95% A。

電喷雾离子源（ESI），离子源温度为150℃，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂气和锥孔气均为N2，脱溶剂气流速为1000 L/h，锥孔气流速为40 L/h。序号1～16霉菌毒素采用正离子监测，序号17～21霉菌毒素采用负离子监测方式。采用MRM多反应监测方式检测，监测离子、碰撞能量、锥孔电压等参数见表2。

3结果与讨论

3.1质谱条件的优化

以甲醇水（50∶50， V/V）为流动相，采用结合（Combine）进样方式，对21种霉菌毒素的质谱条件进行优化，在正、负离子模式下进行全扫描，选择合适的准分子离子峰和电离方式。根据不同化合物的响应，设置不同的扫描模式。其中，正电离模式下获得[M+]+或 [M+N4]+，负电离模式下获得[M-]-。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，进一步优化参数，确定了各种毒素在多反应监测模式下信号采集的特征离子对（表2）。对于具有相同保留时间的同分异构体3AcDON和15AcDON，选择各自特有的离子碎片作为监测子离子。

3.2色谱条件优化

根据本实验室前期研究结果[23]，采用0.1%甲酸和0.1%甲酸甲醇作为流动相，梯度洗脱，分段采集目标物峰信号，适用于多种霉菌毒素的同步检测。由于部分目标物母离子电离方式是+N4的方式，所以在流动相0.1%甲酸中添加0.5 mmol/L乙酸铵，以获得更好的峰响应信号。本流动相梯度设定对于具有相同离子碎片的同分异构体αZEL、βZEL以及αZAL和βZAL能够通过保留时间实现良好分离。图1为空白猪血浆加标的定量离子色谱图。

3.3提取方法的优化

选择血浆样品3倍体积的0.1%甲酸乙腈作为提取液，主要考虑到乙腈既能够沉淀血浆中的蛋白，也是霉菌毒素目标物的良好溶剂，在NaCl和无水MgSO4的盐析作用下，待测霉菌毒素能够很好地从血浆中进入乙腈层，甲酸则有助于保持酸性提取和净化体系。对提取方式考察表明，本实验的提取条件下，除黄曲霉毒素M1萃取率偏低外，其它待测目标物的萃取率均超过80%。为避免在加入无水MgSO4时溶液发热，提前将样品置于4℃冷藏20 min。

3.4净化材料的选择

考察了C18， PSA， AAL和GCB对猪血浆样品中目标物的净化回收效果。结果表明，GCB对大部分目标物有强吸附作用，回收率<30%，C18， PSA和AAL对目标物均无明显吸附作用，回收率在80%～120%之间。C18可以吸附血浆中脂肪和脂类等非极性的组分，降低检测过程中的杂质干扰； PSA可以有效去除样品中的有机酸和色素，而且对于大部分目标物质谱峰相应信号具有明显增强效果； AAL也有一定的脱脂效果，并能够显著降低AFB1， 2， DON和ZEA等目标物的基质干扰，提高检测灵敏度。其次，应用20个不同来源的猪、绵羊、奶牛等血浆样品，进一步考察了C18、PSA和AAL的适宜添加量。结果显示，C18、PSA和AAL各100mg即可对4 mL样品提取液进行有效净化。 此外，还发现由于样品提取液中存在少量水会影响到样品的浓缩过程，添加600 mg无水MgSO4可以有效去除待净化提取液中残存的水。

3.5基质效应评价

用0.1%甲酸乙腈（70∶30， V/V）配制系列梯度浓度（目标物序号1～9为0.05， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0和20.0 ng/mL； 目标物序号10～21为0.25， 0.5， 2.5， 5.0， 25.0和100.0 ng/mL）混合标准溶液，同时量取猪血浆样品，按照前处理步骤提取、

净化和分析，确定不含痕量目标物后，再用空白样品进样液稀释与溶剂标样浓度相同的系列基质匹配标样，分别以标样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析。

基质匹配与溶剂标样曲线斜率的比值（图2）可反映出基质效应的强弱，0.8～1.2可认为是无基质效应，超过这一范围则表明具有较强的基质抑制或增强效应。由图2可见，AFB1等12种目标物在0.8～1.2内，而SE等9种目标物则低于0.8。因此，采用基质匹配标准溶液进行定量分析。

3.6方法的线性范围与定量限

用空白样品提取液配制混合标准溶液，配制浓度为0.05～20 ng/mL（目标物序号为1～9）和0.25～100 ng/mL（目标物序号为10～21），根据10倍信噪比（S/N）确定化合物的方法定量限（LOQ），以浓度为横坐标和定量离子对峰面积为纵坐标进行线性回归计算， 线性相关系数（R2）均大于0.99，结果见表3。

3.7回收率和精密度实验

采用猪血浆空白样品，进行添加回收和精密度实验。样品中添加低、中、高3个浓度梯度的混合标准溶液，每个添加浓度设6个平行样本，按本实验方法进行样品处理和测定， 结果见表4，平均回收率为62.0%～116.4%，相对标准偏差（RSD）为0.9%～19.0%。

3.8实际样品分析

应用本方法对分别经静脉同时注射AFB1、DON和ZEA低、高两种剂量（低浓度： 5， 15和15 μg/kg BW； 高浓度： 10， 30和30 μg/kg BW）2 h后的绵羊血浆样品进行测定，低剂量组检出AFB1、DON、ZEA药物原型及代谢物AFM1、αZEL和βZEL的浓度分别为1.75， 0.25， ND， 0.28， 0.55和0.51 ng/mL； 高剂量组检出浓度分别为6.24， 2.72， 1.15， 1.58， 1.31和1.15 ng/mL，血浆中霉菌毒素及其代谢物浓度与给药剂量呈正相关。结果表明，本方法能够对动物血浆样品中多种霉菌毒素同时进行快速、灵敏的检测，适用于动物霉菌毒素暴露的风险评估和毒代动力学等研究。

AbstractA novel method for simultaneous detection of mycotoxins （e.g.， aflatoxin B1） or their metabolic residues in animal plasma with impurity adsorption purification followed ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was developed. Extraction of mycotoxins and their metabolites from animal plasma sample was performed with 0.1% formic acidacetonitrile solution after addition of sodium chloride and hydrous magnesium sulfate. he extract was then dehydrated and purified with hydrous magnesium sulfate， C18， primary secondary amine， and aluminaA. 3 mL of the supernatant was evaporated and redissolved with 0.5 mL of 0.1% formic acid aqueous solution/acetonitrile （70∶30， V/V） for UPLCMS/MS detection. he analytes were separated by a C18 column utilizing gradient elution with 0.1% formic acid aqueous solution containing 0.5 mmol of ammonium acetate and 0.1% formic acidmethanol solution， and finally detected by tandem mass spectrometry in positive/negative ESI mode. Identification and quantification were achieved by LCMS/MS with multireaction monitoring （MRM）. Good linearity in response was obtained in the analytes concentration range of 0.05-100 ng/mL with correlation coefficients larger than 0.99. he limits of quantification （S/N=10） were around 0.05-0.5 ng/mL. he recoveries of mycotoxins and their metabolites spiked in blank plasma samples were in the range of 62.0%-116.4%， with relative standard deviations （RSDs） less than 19.0%.

KeywordsLiquid chromatographytandem mass spectrometry； Plasma； Mycotoxins； Residue