Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞减数分裂和皮质反应的研究

朱秀兰，易艳红，唐婷，张春晖，刘风华*

(1.广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科，广州 510000；2.北京大学深圳医院生殖医学科，深圳 518000)

Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞减数分裂和皮质反应的研究

朱秀兰1，易艳红1，唐婷1，张春晖2，刘风华1*

(1.广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科，广州 510000；2.北京大学深圳医院生殖医学科，深圳 518000)

目的 探讨Synaptotagmin1(Syt1)对小鼠卵母细胞减数分裂过程和皮质反应的影响。 方法 免疫印迹检测Syt1在小鼠卵母细胞的表达；免疫荧光分析Syt1在卵母细胞中定位以及对减数分裂过程的影响；活细胞实时拍摄系统观察皮质反应以及纺锤体、染色体在降调Syt1表达的动态变化。 结果 (1)Syt1和小鼠卵母细胞皮质颗粒完全共定位；(2)降调Syt1表达，小鼠卵母细胞减数分裂进程受到阻碍；(3)活细胞实时拍摄系统证实了降调Syt1会影响中后期转换、第一极体释放以及进一步的皮质反应。 结论 Syt1参与调控卵母细胞的减数分裂的成熟过程和皮质反应的发生。

Synaptotagmin1； 减数分裂； 皮质反应； 卵母细胞

(JReprodMed2017，26(2)：163-167)

Synaptotagmin1(Syt1)是一种神经突触囊泡蛋白，用于调节神经递质的释放，近来被发现在神经元树突和轴突的分化中也有重要的作用[1-3]。目前为止，Syt1在生殖细胞中的功能研究较少。本文通过Syt1特定寡核苷酸序列(morpholino，MO)降调小鼠卵母细胞Syt1的表达，深入系统地研究了Syt1在小鼠卵母细胞发育过程和孤雌激活后的表达和作用；用活细胞工作站成像系统实时观察发现Syt1参与了小鼠卵母细胞减数分裂的成熟过程和皮质反应的发生。

资料与方法

一、研究对象及试剂

1.研究对象：4～6周龄ICR品系雌性小鼠(购自北京维通利华，SPF级，SCXK京，2012-0001)。

2.主要试剂：兔抗Syt1抗体(Abcam，英国)；TMA-DPH探针(Molecular Probes，美国)；CY5标记的羊抗兔IgG(Jackson，美国)；FITC-LCA，M2/M16培养液及其他化学用品来自美国Sigma公司。

3.主要仪器：激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510 META，德国蔡斯)；活细胞共聚焦成像系统(Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX，Perkin Elmer，美国)。

二、实验方法

1.卵母细胞的收集和培养：断颈法快速处死小鼠后取出卵巢，将卵巢切碎于一次性培养皿中，收集GV期卵母细胞置于M2培养滴中，清洗5～6次后，移至覆盖有矿物油的M16培养滴或者含有2.5 μM米力农(深圳思科达生物公司，深圳)的M2培养滴，置于培养箱中培养(37℃，5% CO2，95%湿度)。培养到不同时期后取出用于免疫印迹、免疫荧光、激光共聚焦扫描显微镜及其活细胞动态观察。

2.MO和β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA联合注射：MO是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子。本实验所用的MO购自美国GENE TOOLS 公司。Syt1-MO序列信息如下：5'-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-3'；对照MO序列信息如下：5'-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3'。用Sigma水稀释，工作浓度为4 mM。通过注射5～10 pL的4 mM MO或者和同体积的β5-tubulin-GFP mRNA(纺锤体)和H2B-RFP mRNA(染色体)的混和物。然后卵母细胞在含2.5 μM米力农的M2培养液中培养24 h。新鲜M2培养液中洗5遍，置于新鲜M16培养液培养约2～3 h，然后放置活细胞工作站继续培养14～15 h左右，并实时动态观察其变化。注射过程中GV期卵母细胞均置于含有2.5 μM米力农的M2培养液中，30 mins内完成操作。

3.卵母细胞的活细胞动态观察实验：向GV期卵母细胞中注射上述Syt1或对照MO和mRNA的混合物用于追踪纺锤体、染色体在卵母细胞成熟过程中的动态变化。经注射的卵母细胞培养至GVBD(约4～5 h)后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX 活细胞共聚焦成像系统，继续培养14～15 h左右，使用窄带通滤波器和一个绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白30%的削减中性密度日色度过滤器，根据tubulin-GFP和H2B-RFP的荧光强度，曝光时间在300毫秒到800毫秒之间，用IP Lab(Scanalytics) 或 AQM6(Andor/Kinetic-imaging)的软件系统支持数字化的延时成像技术。

4.孤雌激活和皮质反应的观察：为明确Syt1对小鼠卵母细胞皮质颗粒发生皮质反应的影响，首先收集正常培养的MⅡ期成熟卵母细胞，台氏酸去除透明带，放置在现配现用的SrCl2-CZB培养液(10 mM)中进行孤雌激活，收集激活后不同时间点的受精卵用免疫印迹法检测Syt1的表达水平。其次用活细胞成像系统观察降调Syt1的表达对卵母细胞SrCl2孤雌激活后的皮质反应是否有影响。向GV期卵母细胞中注射Syt1-MO或者对照MO，每个卵母细胞大约注射10 pL。经注射的卵母细胞继续培养12 h。收集Syt1降调后仍有第一极体释放和对照组的MⅡ卵母细胞，同上方法进行孤雌激活，同时用TMA-DPH探针标记皮质颗粒。然后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX活细胞共聚焦成像系统观察。

三、统计分析

结 果

一、Syt1和皮质颗粒在小鼠卵母细胞中的共定位和表达

体外培养小鼠卵母细胞0 h、8 h和12 h分别对应GV、MⅠ和MⅡ期，用免疫印迹法半定量检测其表达水平，结果显示：在小鼠卵母细胞发育的各个时期均有Syt1的表达(图1A)。免疫荧光检测Syt1和皮质颗粒的亚细胞定位，结果显示Syt1和皮质颗粒两者完全共定位，主要分布在皮质区，MⅠ期，染色体靠近的1/3皮质区域没有表达(图1B)。

二、降调Syt1对小鼠卵母细胞第一次减数分裂前中期/中期阻滞及极体排出率的影响

使用Syt1特异性反义寡核苷酸MO注射，结果显示Syt1-MO显著降调了Syt1的表达(图2A)。经注射的GV期卵母细胞，转移到M16培养液中继续培养10 h或者12 h，10 h收集AI期卵母细胞，Syt1-MO注射组Pro-MⅠ/MⅠ阻滞率为91.80 %(n=49)，较对照MO注射组31.48%(n=54)显著增加，差异有统计学意义(P=0.001)(表1)；12 h收集的卵母细胞中，Syt1-MO注射组极体排出率(45.33%，n=154)与对照组(60.76 %，n=161)相比，差异有统计学意义(P<0.005)(表2)。

GV：生发泡期卵母细胞，MⅠ：第一次减数分裂中期卵母细胞，MⅡ：第二次减数分裂中期卵母细胞；CGs：皮质颗粒。图1 Syt1和皮质颗粒在小鼠卵母细胞中的共定位和表达。1A：小鼠卵母细胞体外培养GV、MⅠ、MⅡ时期Syt1的表达，Syt1和标准量β-actin的分子量分别为47 kDa 和42 kDa；1B：Syt1和皮质颗粒的亚细胞定位，Syt1(粉红色)，CGs(绿色)，DNA(红色)，merge(sytl+CGs+DNA)。

组别无Pro-MⅠ/MⅠ阻滞有Pro-MⅠ/MⅠ阻滞Syt1-MO组4/49(8.20)*45/49(91.80)*对照MO组37/54(68.52)17/54(31.48)

注：与对照组比较，*P<0.001

表2 Syt1-MO组与对照组极体排出率的比较[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.005

三、降调Syt1对小鼠卵母细胞染色体分离和第一次减数分裂过程的影响

向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA和Syt1-MO或对照-MO的混合物，并应用活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺锤体和染色体的动态变化。结果显示，对照组中约GVBD后2 h开始形成纺锤体，之后完整的双极纺锤体逐渐移至皮质区，接着中后期转换完成，约观察7 h发现第一极体(图2B)。共观察约40个对照组卵母细胞，几乎所有细胞在不同的减数分裂时期均呈现出对应各时期的正常形态纺锤体和排列正常的染色体，大部分均能完成第一极体释放。然而，在Syt1-MO注射组卵母细胞出现各种形态异常的纺锤体，染色体不能正确分离，染色体和纺锤体均出现紊乱分散在胞内，且部分染色体脱离纺锤体，接着出现异常的纺锤体和染色体重新聚合又分离现象，直至最后仍无第一极体出现(图2C)。大部分卵母细胞均出现类似上述现象，只有少数卵母细胞出现第一极体释放。

图2 降调Syt1对染色体分离及第一次减数分裂过程和极体释放的影响。2A：免疫印迹验证降调Syt1的表达；2B：对照MO组卵母细胞纺锤体和染色体的动态变化；2C：Syt1-MO组卵母细胞纺锤体和染色体的动态变化。Tubulin(绿色)；DNA(红色).

四、小鼠卵母细胞孤雌激活后Syt1的蛋白表达

体外培养小鼠卵母细胞12 h对应MⅡ期成熟卵母细胞，观察SrCl2孤雌激活后30 min、1 h、2 h、8 h、12 h和24 h的Syt1的表达情况，结果显示：孤雌激活后30 min和1 h时表达量最少，之后随着受精卵的形成表达逐渐增加(图3)。

图3 Syt1在SrCl2孤雌激活后的表达：Syt1和标准量GADPH的分子量分别为47 kDa和36 kDa

五、降调Syt1的表达对卵母细胞皮质反应的发生影响

用活细胞成像系统观察降调Syt1的表达对卵母细胞SrCl2孤雌激活后的皮质反应是否有影响，观察TMA-DPH荧光强度的变化，计算荧光强度快速增强时变化的时间，结果显示:Syt1-MO注射组时间为(10.80±2.47)s(n=10)，较对照MO注射组(4.61±1.40)s(n=15)显著延长，两组相比差异有统计学意义(P<0.01)(表3)。

组别Mean±SD(s)t值P对照MO组4.61±1.40Syt1-MO组10.80±2.474.20.01

讨 论

Syt1是神经突触囊泡蛋白，与神经和内分泌细胞中钙离子结合引起神经递质和内分泌细胞颗粒释放进一步引起相应的生物学行为甚至导致疾病的发生[4-6]。本研究我们对Syt1在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程和皮质反应的新功能进行了探讨。MO广泛应用于降调特定基因的表达，比如，MO降调SGK1基因会改变成年鳉鱼中囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)的表达从而改变其生存环境[7]。纺锤体检点蛋白阻止后期促进因子复合物(APC)的活性直至所有着丝粒全部连接到纺锤体上，卵母细胞分裂后期才开始启动[8]，近来也不断发现新的蛋白分子参与卵母细胞减数分裂过程的调节[9-10]。纺锤体检验点蛋白Bub3突变会阻碍SAC激酶Bub1的着丝粒募集，提示其是在减数分裂信号通路中所必须[11]。本实验结果表明Syt1在小鼠卵母细胞中和皮质颗粒完全共定位。本实验运用MO方法降调Syt1的表达，结果显示：卵母细胞发育阻滞在Pro-MⅠ/MⅠ阶段、第一极体释放和皮质反应受阻。

哺乳动物卵母细胞成熟过程经历两个重要的调节阶段：第一次减数分裂前中期和第一次减数分裂中期的调控。正确的染色体分离过程受多重严密的信号网络调节，否则会导致卵母细胞成熟障碍、胚胎非整倍体发生甚至会进一步影响到子代健康[12-13]。本实验中一个重要发现是Syt1降调的卵母细胞在分裂进程中阻滞在Pro-MⅠ/MⅠ时期。活细胞成像系统结果表明Syt1-MO组卵母细胞纺锤体异常；染色体分离失败，部分染色体脱离微管；而且极体释放受阻；研究结果提示，Syt1很可能参与了小鼠卵母细胞成熟过程中的中后期转换环节。

卵母细胞中存在有皮质颗粒，当其受精或者孤雌激活时会引起皮质颗粒和胞膜的融合，发生皮质反应，即皮质颗粒的胞吐作用。皮质反应是卵母细胞受精过程的初始事件，是阻止多精受精重要的一个环节，对后续胚胎正常受精及其妊娠是重要的基础[14]。皮质反应的具体机制尚不是很清晰，Bello等[15]最近发现作为GTP结合蛋白亚族成员的Rab3A蛋白，可能参与到小鼠卵母细胞的皮质反应过程。本实验中发现Syt1与皮质颗粒完全共定位，Syt1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。虽然Syt1降调后对第一极体释放有阻碍，但是仍有部分卵母细胞在Syt1降调后有极体释放，所以选择Syt1降调后形态学上观察有极体释放的MⅡ卵母细胞，用活细胞成像系统观察降调Syt1的表达对卵母细胞SrCl2孤雌激活后的皮质反应是否有影响，结果发现Syt1降调后影响了皮质反应的发生，孤雌激活后30 min和1 h Syt1的表达量很少，之后随着受精卵的形成Syt1表达也逐渐增多，这个变化与皮质颗粒发生皮质反应的过程也相符合，推测Syt1很可能参与到小鼠卵母细胞的皮质反应过程。

总之，本实验结果表明Syt1作为神经突触囊泡蛋白分子，在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程、第一极体释放和皮质反应方面发挥着重要的功能。

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[编辑：辛玲]

Synaptotagmin 1 affects meiosis and cortical reaction in mouse oocytes

ZHUXiu-lan1，YIYan-hong1，TANGTing1，ZHANGChun-hui2，LIUFeng-hua1*

1.DepartmentofReproductiveHealthandInfertility，MaternalandChildHealthHospitalofGuangdongProvince，GuangzhouMedicalUniversity，Guangdong510000 2.DepartmentofReproductiveMedicinePekingUniversityShenzhenHospital，MedicalCenterofPekingUniversity，Guangdong518000

Objective：To identify the effect of Synaptotagmin 1(Syt1) on meiosis and cortical reaction in mouse oocyte.Methods：Syt1 expression was determined by immunoblotting analysis.The localization of Syt1 in oocytes and the effect on meiosis processes were analyzed by immunofluorescence.Cortical reaction and the dynamics of microtubule and chromosome were filmed with Perkin Elmer precisely Ulta VIEW VOX Confocal Imaging System.Results：Syt1 expression was localized at the same position as cortical granules(CGs) in mouse oocyte.Down-regulation of Syt1 expression interrupted the meiotic process in mouse oocyte.The results of Perkin Elmer precisely Ulta VIEW VOX Confocal Imaging System confirmed that down-regulation of Syt1 affected MI and MII conversion，the first polar body release and further cortical response.Conclusions：Syt1 is involved in mouse oocyte meiotic maturation process and cortical reaction.

Synaptotagmin1； Meiosis； Cortical reaction； Oocyte

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.02.012 ·实验研究·

2016-10-17；

2016-10-30

国家自然科学基金(2013-81300479)&深圳市科创委面上项目(JCY20120616144719076)

朱秀兰，女，安徽砀山人，博士，主治医师，生殖医学专业.(*

，Email：liushine2006@163.com)