羽绒中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌荧光PCR检测方法研究

何永盛+林霖+赖心田+王坤+吴佳辉+陈国培

摘要：现有标准对羽绒服装产品中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检测存在检测周期长、结果缺乏确证手段等不足之处，需要建立更为快速准确的检测方法进行补充和完善。本研究建立了可用于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌鉴定的实时荧光PCR检测方法，并对该方法的特异性和检出限进行了分析验证，结果显示建立的方法具有良好的特异性，检出限为20 CFU/mL。在50批次样品检测中，本研究建立的方法与国标检测方法具有较好的一致性，可以应用于羽绒服装样品的日常检测。

关键词：羽绒；亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；实时荧光PCR

中图分类号：TS107 文献标志码：A

Research on Fluorescence PCR Method for Detecting Sulfite-reducing Clostridia in Down Products

Abstract： Sulfite-reducing clostridia is an important detection index for down products. Due to long testing period and insufficient accuracy， the existing standard test method should be further complemented and improved. Hence， it is necessary to develop a quick and accurate detection method. In this study， a fluorescence PCR method for detecting sulfite-reducing clostridia was established， and the sensitivity and detection limit of the method were analyzed and verified by subsequent experiments. The experiment results showed that the established method can distinguish sulfite-reducing clostridia from other bacteria effectively， and its detection limit reached 20 CFU/mL. The testing of fifty lots of down products verified that the established method is consistent with national standard test method and it can be applied to routine testing of down products.

Key words： down product； sulfite-reducing clostridia； fluorescence real-time PCR

我國是羽绒及其制品的生产、出口和消费大国，近年来羽绒的安全卫生问题越来越受到人们的关注。微生物卫生指标不合格是制约我国羽绒服装产品出口的一个重要因素。目前，我国和欧盟的相关标准都对羽绒产品的微生物限量提出了明确的要求。作为羽绒服装产品检测中的重要微生物指标之一，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌对外界环境有极强的耐受能力，高温灭菌等一般的灭菌方法难以将其杀死，因此在检测当中往往成为导致羽绒服装产品不合格的主要污染菌。我国羽绒服装中针对该菌的检测多采用国家标准GB/T 14272 — 2011《羽绒服装》中规定的方法，主要通过测定平板上的黑点状菌落数目来判定该菌是否超标。这种检测方法虽然操作简单，但却也存在检测周期过长以及检测结果缺乏确证手段等不足之处，因此有必要建立更为快速准确的检测方法对其进行补充和完善。

实时荧光PCR技术操作简便、灵敏度高、特异性强，已广泛应用于多种病原微生物的快速检测当中，然而将其应用于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检测的研究在国内外仍未见报道。本研究拟利用实时荧光PCR技术建立可用于鉴定亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检测方法，并将其应用于羽绒产品的实际检测当中。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

羽绒服装样品均由客户提供。丁酸梭菌（CICC 10390）、巴氏梭菌（CICC 10391）、索氏梭菌（CICC 22950）、双酶梭菌（CICC 22952）、拜氏梭菌（CICC 22954）、产气荚膜梭菌（CICC 22949）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 实验试剂

蛋白胨水、亚硫酸铁多粘菌素B琼脂、强化梭菌培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；2×premix ExTaq酶购自宝生物工程（大连）有限公司；实验中所用引物及探针（表 1）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 引物和探针的设计

通过测序以及在数据库中查找的方式获得17种亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的16SrRNA序列，通过序列比对设计出特异性的引物和探针。各菌种的名称及其序列来源如表 2 所示，其中丁酸梭菌等 6 个菌种的序列通过自行测序获得，所用引物为文献报道的菌种16SrRNA测序引物（表 1），其他菌种序列来源于NCBI数据库。

1.2.2 菌株基因组DNA的制备

以水煮法制备标准菌株的基因组DNA。对 6 株亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌进行增菌培养，取 1 mL菌液，12 000 r/min离心 5 min，弃上清；加入100 μL去离子水重悬菌体，沸水浴加热 5 min；12 000 r/min离心 5 min，转移上清液至新的离心管，-20 ℃条件下保存备用。

1.2.3 荧光PCR检测体系的建立及结果判定

反应体系为20 μL，其中 2×premix ExTaq为10 μL，引物（Clostridium-Forward和Clostridium-Reverse）各0.2 μmol/L，探针（Clostridium-Probe1和ClostridiumProbe2）各0.1 μmol/L，标准菌株DNA为 2 μL。

反应程序：95 ℃时 1 min；95 ℃时10 s，55 ℃时20 s，72 ℃时34 s，40个循环。

结果判定：Ct值≤35时，可判定结果为阳性；Ct值≥40时，可判定结果为阴性；35

1.2.4 方法特异性检验

选取丁酸梭菌等 6 种亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌及27种其他细菌，用水煮法提取基因组DNA，使用特异性的引物和探针进行荧光PCR反应，以验证方法的特异性。

1.2.5 方法检出限测试

通过前期实验测试发现双酶梭菌是羽绒服装产品中经常被检出的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，因此选取该菌作为方法检测出限测试的代表菌株。对双酶梭菌进行增菌培养，离心收集菌体，用生理盐水重悬至 1 个MCF（麦氏单位），并以此为母液进行梯度稀释，最低稀释度为10-8 MCF。以水煮法提取每个稀释度菌液的DNA，用建立的方法进行荧光PCR检测，每个稀释度设置 2 个平行，同时取10-4、10-5、10-6 MCF 3 个稀释度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》规定方法进行菌落计数。

1.2.6 实际样品检测

选取50批次羽绒服装样品检验方法的实际适用性。取出 3 g样品至无菌袋中，加入300 mL蛋白胨水，20 ℃恒温振荡培养 3 h；转移10 mL样液至试管中，75 ℃加热10 min；吸取 1 mL加热后的样液至10 mL强化梭菌培养基中，37 ℃厌氧培养过夜，次日以水煮法制备测试所需的DNA，用设计的特异性引物和探针进行荧光PCR反应，同时把各批次样品按GB/T 14272 — 2011规定的方法进行检测，对比 2 种方法的检测结果。

2 结果

2.1 方法特异性实验结果

以丁酸梭菌等 6 种亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌以及27种其他细菌检验方法的特异性，结果表明设计的引物和探针具有良好的特异性，对 6 种亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌都能扩增出特异性的曲线，而对其他27种细菌种则没有非特异扩增，检测结果如表 3 所示。

2.2 方法检出限实验结果（图 1）

选取10-4、10-5、10-6 MCF 3 个稀释度菌液涂布平板，按GB 4789.2 — 2010规定的方法进行菌落计数。经计算，浊度为 1 MCF的双酶梭菌菌液对应的菌落数为2×107 CFU/mL。取每个稀释度菌液 1 mL，以水煮法提取DNA，使用亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌特异性引物和探针进行荧光PCR反应，扩增结果显示方法的最低检测限为20 CFU/mL。

2.3 实际样品检测结果

利用建立的荧光PCR检测方法以及GB/T 14272 —2011中规定的方法对50批次羽绒服装样品进行检测（表4）。结果显示，本研究建立的方法检出有 9 批次样品的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌含量≥100 CFU/g，而GB/T 14272 — 2011规定的方法则检出 8 批次样品的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌含量超标，2 种方法的检测结果具有较高的一致性。

3 討论

在针对单一病源微生物进行检测时，研究人员往往会选择其特有的毒力基因或抗原基因来设计引物和探针，然而亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌是一类形态各异、营养类型多样的微生物，寻找它们共有的抗原基因或毒力基因存在较大的难度。由于16SrRNA基因序列长短适中，其结构中既有保守区又有变异区，是较好的生物标志物。因此本研究选择以此作为靶基因，对17种亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的16SrRNA序列进行比对，寻找可用于设计特异性引物和探针的基因位点，建立了可以用于该类细菌鉴定的实时荧光PCR检测方法。

在50批次羽绒服装检测当中，本研究建立的方法与GB/T 14272 — 2011中规定的方法在检测结果上具有较好的一致性，仅 1 个批次样品检测结果存在差异。这可能是由于本研究采用的方法经过增菌培养，而且荧光PCR检测方法又具有极高的灵敏度，从而在一定程度上提高了该类细菌的检出率。GB/T 14272 — 2011采用的检测方法仅微物生培养就需要耗费48 h，而本研究建立的荧光PCR检测方法可以有效缩短检测周期，更能适应大批量样品在检测时效性方面的需求。另外，微生物检测的最终确证往往需要进行一系列的生化实验，而国家标准中采用的检测方法只是简单地通过菌落的形态和颜色来进行判别，缺乏进一步确证的方法，因此本研究建立的方法也可以作为辅助国标检测方法进行结果确证的一个有效手段。

参考文献（略）