抗胶质瘤Ⅰ号方对脑胶质瘤细胞侵袭性的影响

刘春玲+唐明科+秦丽娟

【摘要】 目的：探讨抗胶质瘤Ⅰ号对胶质瘤细胞侵袭性降低的作用及其与PI3K/PKB信号传导通路之间的关系。方法：MTT法检测抗胶质瘤Ⅰ号处理培养的C6胶质瘤细胞的抑制率，免疫印迹法检测肿瘤细胞内PI3K和PKB表达水平，最后，利用结晶紫染色法检测Transwell下室面的胶质瘤细胞数。结果：抗胶质瘤Ⅰ号可以抑制PI3K和PKB蛋白表达水平，抗胶质瘤Ⅰ号作用0.5 h时PI3K蛋白表达水平最低为（25.1±3.1），作用1 h时PKB蛋白表达水平最低为（25.1±3.8），与对照组的（99.1±1.6）、（91.2±3.5）比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。而抗胶质瘤Ⅰ号作用3 h时对胶质瘤细胞的抑制程度最大，抑制率为（91.2±5.7）%，与对照组的（68.0±5.2）%比较，差异有统计学意义（P<0.01）。且此时Transwell下室面的细胞数最少，为（1.4±0.4）×106个，与对照组的（35.6±2.7）×106个比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：抗胶质瘤Ⅰ号可能是通过抑制PI3K/PKB而抑制胶质瘤细胞的增殖，从而引起胶质瘤细胞侵袭性的降低。

【关键词】 胶质瘤； 抗胶质瘤Ⅰ号； PI3K/PKB信号传导通路

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions on reducing the invasiveness of glioma cells，and the relationship between Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions and PI3K/PKB signal transduction pathway.Method：MTT method was used to detect cell inhibition rate of C6 glioma cells which was treated by the Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，the expression level of PI3K and PKB in tumor cells was detected by Western blot，in the end，the number of glioma cells in Transwell was detected by crystal violet staining method.Result：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions can inhibit PI3K and PKB protein expression level，the expression level of PI3K protein was the lowest （25.1±3.1） when the effect of Resistance to Glioma Ⅰ was 0.5 h，and the lowest level of PKB protein expression was （25.1±3.8） at the effect of Resistance to glioma Ⅰ was 1 h，compared with the control group （99.1±1.6），（91.2±3.5），the differences were statistically significant（P<0.05）.While the largest inhibition rate appear at 3 h after Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，inhibition rate was （91.2±5.7）%， compared with （68.0±5.2）% in control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.At the same time，the glioma cell number on transwell chamber surface was the least（1.4±0.4）×106，compared with（35.6±2.7）×106 in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions may is through the inhibition of PI3K/PKB signal transduction pathway and inhibit the proliferation of glioma cells，thereby reducing the invasiveness of glioma cells.

【Key words】 Glioma； Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions； PI3K/PKB signal transduction pathway

First-arthors address：The Second Hospital of Chifeng，Chifeng 024000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.004

在中枢神经系统肿瘤中，胶质瘤是最为常见的[1-3]。而对于胶质瘤的治疗，除了大家广为熟悉的手术治疗以外，还往往在术后进行相应的放、化疗等辅助治疗[4-5]。这是由于胶质瘤侵袭性高，而手术只能切除成型的病灶，已经侵袭到远处的膠质瘤细胞不易发现也做不到全部清除，因此术后胶质瘤患者往往复发率极高。抗胶质瘤Ⅰ号方中的部分成分已经应用于临床其他肿瘤的治疗并取得了一定的效果，文献[6]研究发现，抗胶质瘤Ⅰ号具有抗胶质瘤作用，但其确切的分子生物学作用机制尚不十分清楚。endprint

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 （1）C6大鼠脑胶质瘤细胞株由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。（2）主要试剂羊抗大鼠PI3K和PKB购自英国Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。抗胶质瘤Ⅰ号组成成分包括鸦胆子口服液、白花蛇草、蜈蚣、水蛭、枸杞子、土茯苓、猪苓、葛根。

1.2 方法

1.2.1 胶质瘤细胞培养 胶质瘤细胞采用F-12培养基培养进行培养，培养基内加入2.5%胎牛血清和15%马血清，37 ℃孵箱内孵育，并通以5%的CO2。细胞生长至对数生长期后，随机分为实验组和对照组。实验组为抗胶质瘤Ⅰ号作用0.1、0.5、1、2、3、4 h 六个时间点，对照组在相应的时间点加入等量生理盐水，每组选10个标本。

1.2.2 免疫印迹法检测胶质瘤细胞内的PI3K和PKB蛋白表达水平 培养的胶质瘤细胞给予抗胶质瘤Ⅰ号后，收集不同时间点（0.1、0.5、1、2、3、4 h）的胶质瘤细胞，细胞进行裂解、超声破碎后，低温离心并收集上清液，采用7.5%的SDS-PAGE进行电泳，每个泳道样本的加样量为30 μg。半干转印结束后用脱脂奶粉封闭1 h后并4 ℃过夜。次日取出NC膜分别加入PI3K和PKB的一抗震荡孵育2 h。TTBS洗后行二抗震荡孵育1 h。TTBS洗后的NC膜采用增强化学发光检测，结果用IDV值进行分析。

1.2.3 抗胶质瘤Ⅰ号对肿瘤细胞增殖的影响 培养的胶质瘤接种于96孔板，密度调整为1×104个细胞/孔，细胞增殖至对数生长期24 h后，细胞培养液内加入抗胶质瘤Ⅰ号，对照组加入不含血清的培养基。MTT染色法检测抗胶质瘤Ⅰ号作用后不同时间点的胶质瘤细胞增殖抑制率。

1.2.4 结晶紫染色法检测胶质瘤侵袭性 Transwell膜上室接种胶质瘤细胞，密度为5×104个/膜，培养24 h后，分别于抗胶质瘤Ⅰ号作用后不同时间点用测定Tanswell膜下室面的贴壁细胞数目。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞内PI3K的表达水平 抗胶质瘤Ⅰ号处理后的胶质瘤细胞，PI3K的表达水平降低，于抗胶质瘤Ⅰ号处理后的0.5 h时达最低为（25.1±3.1），与对照组的（99.1±4.2）比较，差异有统计学意义（P<0.01），其后随时间PI3K的表达水平逐渐增高，见图1。

2.2 胶质瘤细胞内PKB的表达水平 抗胶质瘤Ⅰ号处理后，胶质瘤细胞内PKB的表达水平降低，并于抗胶质瘤Ⅰ号处理后的1 h时达最低（25.1±3.8），与对照组的（99.4±3.1）比较，差异有统计学意义（P<0.05），其后PKB的表达水平逐渐增高，见图2。

2.3 抗胶质瘤Ⅰ号对胶质瘤细胞增殖的影响 抗胶质瘤Ⅰ号处理作用于胶质瘤细胞后，选取抗胶质瘤Ⅰ号作用0.1、0.5、1、2、3、4 h六个时间点的胶质瘤细胞，每个时间点选取10例标本，分别观察抗胶质瘤Ⅰ号作用于胶质瘤后的不同时间点引起胶质瘤细胞抑制率的变化。结果发现，抗胶质瘤Ⅰ号作用于胶质瘤细胞后，随时间延长，抑制率开始增大，于3 h时抑制程度最大，其后又随时间的延长而降低。其中，抗胶质瘤Ⅰ号作用于胶质瘤细胞后的2、3 h时，其抑制率分别为（68.0±5.2）%和（91.2±5.7）%，与对照组的（9.5±1.5）%、（9.4±2.1）%比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.4 抗胶质瘤Ⅰ号对胶质瘤细胞侵袭性的影响 抗胶质瘤Ⅰ号可使得侵入transwell下室的细胞数量减少，于处理后的3 h时明显降低，提示抗胶质瘤Ⅰ号可降低胶质瘤侵袭性，并且于抗胶质瘤Ⅰ号作用3 h时降至最低，侵袭细胞数为（1.4±0.4）×106个，与对照组的（35.6±2.7）×106个比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

3 讨论

神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，近年来，神经胶质瘤发病率有逐年升高的趋势，且其发病群体也日趋年轻化[7-8]。胶质瘤的临床主要表现为一系列的脑组织压迫症状。在临床上，胶质瘤的治疗依然以手术为首选。但因胶质瘤高侵袭性的特点，使得手术无法做到病理学上的彻底清除。因此，即使患者术后短期效果明显，但很快又会复发，严重影响了胶质瘤患者的生活质量和生命周期[9]。为了最大程度减少或消除胶质瘤复发的概率，胶质瘤患者术后通常均辅助放射治疗或化学治疗，但这两种治疗方法同时又会产生大的副作用，因此，效果往往差强人意。随着中医中药的研究进展，临床上中医中药治疗脑瘤的成功报道亦日趋增多[10-12]。在很多临床与实验研究中发现，中医中药确实可以控制患者的疾病发展与转归，可以减少由放、化疗造成的不良反应，提高患者的生活质量和生存周期。

脑胶质瘤的中医病机主要可分为以下几个方面，（1）痰湿内阻型：痰湿之邪长久不化，弹性重浊黏腻，凝聚于脑，脉络受阻，形成肿块，阻塞清窍。在其病变过程中，脑络痹阻日久，化热动风，风火相煽，耗伤阴液，致头痛呕吐，昏花复视，肢体偏瘫，甚则昏迷不醒，抽搐癫痫。（2）气滞血瘀型：颅内脉络受阻，邪毒积聚，损伤正气，不化之食、不去之湿日久演变成痰浊积聚，久而瘀血内生，气血耗损，经脉阻滞，形成肿瘤。（3）肝肾阴虚型：肾主骨，骨生髓，脑为髓海，处头部巅顶清虚之地，肾虚可致髓海空虚，邪易乘虚而入。在疾病治疗过程中，中医学强调整体观念，其重在调整机体阴阳、气血、脏腑功能平衡，并因人而異采取标本兼治、扶正祛邪的治疗原则，借此达到提高患者生命周期和生活质量的目的。目前的研究已经发现，抗胶质瘤Ⅰ号方剂中的很多成分对抗肿瘤有很好的临床疗效[13-15]，但抗胶质瘤Ⅰ号方剂发挥作用的具体机制尚不十分明了。endprint

近年来，关于中草药及其活性成分抗胶质瘤作用的研究已经证实，人参皂甙、紫杉醇、氧化砷、苦参碱、榄香烯、丹参酮等多种中药以及合剂对抗胶质瘤的作用机制主要包括：影响胶质瘤细胞周期；抑制癌发生相关基因的表达；调节机体免疫功能；抑制肿瘤血管生长；诱导肿瘤细胞分化；调节肿瘤细胞信号传导；抑制端粒酶活性和细胞毒作用等[16-18]。中药诱导胶质瘤细胞凋亡是通过多靶点、多途径、多环节来实现的。

笔者通过研究抗胶质瘤Ⅰ号对胶质瘤细胞侵袭性、细胞增殖情况，发现抗胶质瘤Ⅰ号方剂可以降低胶质瘤细胞侵袭性，并于抗胶质瘤Ⅰ号作用3 h时最为明显。而抗胶质瘤Ⅰ号对胶质瘤细胞增殖的抑制作用亦于作用3 h时达最高水平。说明抗胶质瘤Ⅰ号可抑制胶质瘤细胞增殖，降低胶质瘤侵袭性。

有研究发现，PI3K/PKB信号通路在机体生命活动过程中的很多方面发挥着重要作用，且常常可被多种肿瘤所激活[19-20]，与肿瘤的发生、发展、转移、耐药性等密切相关[21]。PKB是PI3K的一个重要下游信号分子，可促进细胞恶性转化。

本研究发现，抗胶质瘤Ⅰ号可以降低PI3K信号蛋白的表达，并于抗胶质瘤Ⅰ号作用后的0.5 h时达最低水平，而信号蛋白PKB则在抗胶质瘤Ⅰ号作用后1 h时达最低表达，据此推测，抗胶质瘤Ⅰ号作用于胶质瘤细胞后，可能是通过降低PI3K的表达而激活了其下游的信号分子PKB，通过此信号通路的激活最终引起胶质瘤细胞增殖受抑降低了胶质瘤的侵袭性。

有关抗胶质瘤Ⅰ号降低胶质瘤侵袭性的作用，可能还有其他的信号通路或信号蛋白分子参与其中，亦可能是调动了机体某些内在机制而实现的，这些尚待进一步研究。

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（收稿日期：2016-10-16） （本文編辑：张爽）endprint