不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌葡萄糖转运载体和胰岛素受体表达的发育性变化

刘文佐 左建军 代发文 叶 慧 曹庆云 周响艳 邹仕庚黄志毅 职爱民 冯定远

（华南农业大学动物科学学院，广州 510642）

不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌葡萄糖转运载体和胰岛素受体表达的发育性变化

刘文佐 左建军 代发文 叶 慧 曹庆云 周响艳 邹仕庚黄志毅 职爱民 冯定远∗

（华南农业大学动物科学学院，广州 510642）

本试验旨在研究不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌葡萄糖转运载体（GLUT）1、GLUT4和胰岛素受体（IR）mRNA表达的发育规律。试验以1、7、30、60、90和150日龄蓝塘和长白两品种猪背最长肌、半膜肌和半腱肌组织样品cDNA为模板，采用实时荧光半定量PCR的方法，检测猪GLUT1和GLUT4 mRNA在不同骨骼肌中的表达模式。结果显示：1）1～150日龄蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌GLUT1 mRNA表达存在相似的发育变化规律，在1日龄时相对表达丰度最高。2）1～150日龄蓝塘和长白猪半膜肌和半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化，变化速度和程度存在品种差异。1日龄和150日龄时蓝塘猪背最长肌GLUT4 mRNA相对表达丰度低于同日龄长白猪（P＞0.05），而在其余日龄时高于同日龄长白猪（P＞0.05）。3）蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌IRmRNA相对表达丰度在1和30日龄时表现出较高水平，而在7、60、90和150日龄时无显著差异（P＞0.05）；同日龄蓝塘和长白猪之间IRmRNA相对表达丰度无显著性差异（P＞0.05）。结果表明：猪骨骼肌GLUT1 mRNA的表达在不同生理阶段存在差异，猪骨骼肌GLUT4 mRNA的表达在不同品种和生理阶段存在显著差异，且其与IRmRNA的表达相关性较弱，无明显规律。

猪；生理阶段；葡萄糖转运载体1；葡萄糖转运载体4；胰岛素受体；发育规律

葡萄糖转运载体（glucose transporter，GLUT）是介导葡萄糖分子进入细胞的通道，其表达水平和蛋白质活性对维持机体葡萄糖稳态和提供营养底物具有重要的意义。目前，哺乳动物GLUT可以分为 3类［1］，其中第 1类包括 4种，分别为GLUT1、GLUT2、GLUT3和GLUT4，分布组织广泛，对调节机体葡萄糖稳态具有重要的作用。GLUT1和 GLUT4是骨骼肌最为重要的两类GLUT，其中GLUT1负责转运供应机体基础代谢所需的葡萄糖，而GLUT4受胰岛素敏感性调节。

Hall等［2］在大西洋黑线鳕中研究发现，GLUT4 mRNA的表达在其受精卵中就可检测到，而且从孵化期到幼年时期一直有较高丰度的表达。有研究报道，发现断奶后和成年大鼠空肠GLUT1蛋白丰度显著高于哺乳期［3］。Barfull等［4］在研究中还比较了2日龄和5周龄的鸡肠道中钠-葡萄糖共转运载体（SGLT）1的mRNA的表达，结果显示mRNA的表达存在显著差异。王修启等［5］研究爱拔益加（AA）肉鸡和黄羽肉鸡十二指肠中GLUT2 mRNA的表达，发现其发育模式并不相同，在2～30日龄2种肉鸡中都呈现不断升高的趋势，30日龄以后两者的发育模式完全不同。上述研究说明了不同年龄、不同品种的动物，其GLUT的表达有所差异。此外，目前有关GLUT的研究主要体现人［6-7］、鼠［3-10］和家禽［11-13］上，且对肠道中GLUT的表达研究较多，而其在不同品种猪及生理阶段骨骼肌中的分布表达情况还未见报道。因此，本试验选用地方传统猪种蓝塘猪和外来品种长白猪为试验对象，研究不同品种猪在不同生理阶段骨骼肌GLUT1和GLUT4以及胰岛素受体（insulin receptor，IR）mRNA表达的发育性变化，旨在探讨猪骨骼肌内葡萄糖代谢的分子机制，为进一步研究骨骼肌生长发育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

选取1日龄蓝塘仔猪50头和长白仔猪70头，随机分到5个重复，蓝塘每个重复共10头，长白每个重复共14头。饲养至150日龄，饲养试验在广东省东莞市板岭原种猪场进行，按照试验猪场的饲养管理规程及免疫程序进行饲养。于1、7、30、 60、90和150日龄时分别从蓝塘和长白猪组每个重复中选取接近平均体重的阉公猪进行放血屠宰试验，宰前不禁食。按解剖学位置分别从背最长肌、半膜肌和半腱肌采取组织样放入1.5 mL离心管中，液氮速冻后，转入-80℃冷冻保存备用。

1.2 实时荧光定量检测组织中GLUT1和GLUT4的表达

将分离的不同部位的骨骼肌参照Trizol（北京赛百盛基因技术有限公司）的说明书步骤，分别从3块不同的肌肉部位提取总RNA后进行反转录，而后使用TaKaRa公司提供的PCR试剂盒进行实时荧光半定量PCR检测，参照NCBI公布的猪GLUT1（GenBank登录号：X17058）、GLUT4（Gen-Bank登录号：EU590115）以及IR（GenBank登录号：AF102858）的基因序列，用Prime 5.0软件设计引物（表1），内参基因为 β-肌动蛋白（β-actin），四者的反应条件均为：95℃ 5 min，95℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 20 s共40个循环，72℃ 4 min。

表1 试验引物Table 1 Primers for the experiment

1.3 数据统计与分析

试验数据以平均值±标准误表示。采用SPSS 17.0统计软件分析数据，运用单因子方差分析（one-way ANOVA）模型进行方差分析，运用LSD法进行不同日龄之间差异显著性检验，运用独立样本T检验法进行同日龄蓝塘和长白猪之间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 背最长肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表达的发育性变化

1～150日龄蓝塘和长白猪背最长肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度发育变化比较见图1所示。由图1-A可知，蓝塘和长白猪背最长肌GLUT1 mRNA相对表达丰度具有相似的发育变化规律。2种猪初生时（1日龄）背最长肌GLUT1 mRNA相对表达丰度均显著高于其他日龄（P＜0.05），在7、30、60、90和150日龄时均无显著性变化（P＞0.05）。相同日龄时2品种猪之间背最长肌GLUT1 mRNA相对表达丰度也无显著差异（P＞0.05）。

由图 1-B可知，长白猪背最长肌GLUT4 mRNA相对表达丰度出生时水平较高，随后逐渐降低；7日龄GLUT4 mRNA相对表达丰度显著低于1日龄（P＜0.05），而7、30、60和90日龄与1日龄相比无显著差异（P＞0.05），150日龄达到最高，显著高于其他日龄（P＜0.05）。蓝塘猪背最长肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄变化无明显变化趋势，各日龄之间差异不显著（P＞0.05）。1日龄时长白猪背最长肌GLUT4 mRNA相对表达丰度高于同日龄蓝塘猪（P＞0.05），而后除150日龄外，蓝塘猪背最长肌GLUT4 mRNA相对表达丰度高于长白猪（P＞0.05），其中60日龄时蓝塘猪比长白猪高66.76%。

由图1-C可知，蓝塘和长白猪背最长肌IRmRNA相对表达丰度具有相似的发育变化规律。在1和 30日龄时蓝塘和长白猪背最长肌IRmRNA相对表达丰度均处于较高水平。长白猪1日龄背最长肌IRmRNA相对表达丰度显著高于除150日龄以外的其余日龄（P＜0.05），而7、30、60、90和150日龄间无显著差异（P＞0.05）。1和30日龄蓝塘猪背最长肌IRmRNA相对表达丰度显著高于60日龄（P＜0.05），其余日龄间无显著差异（P＞0.05）。

图1 不同日龄蓝塘和长白猪背最长肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度Fig.1 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin longissimus dorsi muscle ofLantangand Landrace pigs at different days of age

2.2 半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表达的发育性变化

1～150日龄蓝塘和长白猪半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度发育变化比较见图2所示。由图2-A可知，1～150日龄蓝塘和长白猪半膜肌GLUT1 mRNA相对表达丰度存在相似的发育变化规律。1日龄GLUT1 mRNA相对表达丰度显著高于其他日龄（P＜0.05），而在7、30、60、90和 150日龄时无显著差异（P＞0.05）。同日龄蓝塘和长白猪半膜肌GLUT1 mRNA相对表达丰度无显著差异（P＞0.05）。

由图2-B可知，1～150日龄蓝塘和长白猪半膜肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化，长白猪出生后先降低再升高，而蓝塘猪先升高后降低。30日龄时蓝塘和长白猪半膜肌GLUT4 mRNA相对表达丰度均处于最高水平。30日龄长白猪半膜肌GLUT4 mRNA相对表达丰度显著高于7日龄（P＜0.05），而蓝塘猪在30和60日龄时半膜肌GLUT4 mRNA相对表达丰度显著高于其他日龄（P＜0.05）。在7和60日龄时，蓝塘猪半膜肌GLUT4 mRNA相对表达丰度分别比同日龄长白猪高76.98%和74.70%，均达到显著水平（P＜0.05）。

由图2-C可知，蓝塘猪和长白猪半膜肌IRmRNA相对表达丰度均在1和30日龄时表现出较高水平，而在7、60、90和150日龄时无显著差异（P＞0.05）。同日龄蓝塘猪和长白猪半膜肌IRmRNA相对表达丰度均无显著差异（P＞0.05）。

图2 不同日龄蓝塘和长白猪半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度Fig.2 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin semimembranosus ofLantangand Landrace pigs at different days of age

2.3 半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表达的发育性变化

1～150日龄蓝塘和长白猪半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度发育变化比较见图3所示。由图3-A可知，1～150日龄蓝塘和长白猪半腱肌GLUT1 mRNA相对表达丰度均在1日龄时显著高于其他日龄（P＜0.05），而在7、30、60、90和150日龄时均无显著性变化（P＞0.05）。150日龄时蓝塘猪半腱肌GLUT1 mRNA相对表达丰度比同日龄长白猪高58.21%（P＞0.05）。

由图3-B可知，1～150日龄蓝塘和长白猪半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化，长白猪出生后先降低再升高，而蓝塘猪先升高后降低。30日龄时蓝塘和长白猪半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度均处于最高水平。30日龄长白猪半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度显著高于7日龄（P＜0.05），而蓝塘猪在30日龄时显著高于1日龄（P＜0.05），与其他日龄相比无显著差异（P＞0.05）。1日龄时长白猪半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度显著高于同日龄蓝塘猪（P＜ 0.05），而在其他日龄时蓝塘猪仅有高于同日龄长白猪的趋势（P＞0.05）。

由图3-C可知，蓝塘猪和长白猪半腱肌IRmRNA相对表达丰度均在1和30日龄时表现出较高水平，而在7、60、90和150日龄时无显著差异（P＞0.05）。同日龄蓝塘猪和长白猪半膜肌IRmRNA相对表达丰度均无显著差异（P＞0.05）。

3 讨 论

3.1 日龄对骨骼肌GLUT表达的影响

骨骼肌GLUT表达随机体发育而产生变化以满足机体生长代谢的生理需要。Humphrey等［14］在禽类的研究上发现生长鸡GLUT1在孵化后第1天除心脏外在其他组织均无表达，而心脏组织也是在孵化后第3天表达水平急剧下降直到第7天才恢复到第1天水平。本研究发现猪在出生第1天骨骼肌GLUT1具有较高的mRNA表达丰度，随后呈下降趋势，并维持低水平至150日龄。这可能是由于2种动物营养生理差异的原因，禽类孵化后第1天仍由卵黄囊提供机体能量直到其脂肪耗尽［15］，而猪出生时通过采食母乳满足营养需要。Dos Santos等［16］研究了不同发育阶段鼠的骨骼肌GLUT4 mRNA的表达情况，结果表明，鼠比目鱼肌中GLUT4 mRNA的表达与日龄呈负相关，这与发育过程中机体葡萄糖的摄取及代谢有关。本研究发现蓝塘猪和长白猪半膜肌和半腱肌GLUT4 mRNA相对表达丰度随日龄呈波形变化，30日龄时显著高于7日龄，这可能是由于从哺乳期高能量、高脂肪液体乳过渡到断奶期全价饲料原料饲粮，从而影响机体骨骼肌糖代谢所致。也有研究显示饲粮因素会影响GLUT在肌肉中的表达，如Banda等［17］研究发现，持续2周高果糖饲粮使骨骼肌中GLUT4 mRNA表达水平下降27%。

图3 不同日龄蓝塘和长白猪半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相对表达丰度Fig.3 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin semitendinosus ofLantangand Landrace pigs at different days of age

此外，本试验结果发现蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌中GLUT1和GLUT4 mRNA表达发育模式存在极大的差异，GLUT4表达丰度明显高于GLUT1，且在出生后整个试验期内都表现出较高的表达水平。这表明GLUT4是骨骼肌发育过程中主要的GLUT亚型。与此相似，在人肌纤维发育过程中GLUT1和GLUT4表达发育模式存在明显差异，在出生后GLUT1显著下降，并在出生后第1年降至检不出水平，而GLUT4在全期都有较高的表达水平［18］。 然而，Sweazea等［19］在禽类的研究表明GLUT1表达比GLUT4重要。这可能与两类转运载体调节机制和动物机体对胰岛素敏感性差异有关。

3.2 品种对骨骼肌GLUT表达的影响

蓝塘猪是中国地方品种猪，具有典型的传统猪种特征，与外来猪相比生长速度较慢、胴体瘦肉率较低、肌内脂肪含量较高。葡萄糖是哺乳动物机体主要的能量来源，对猪而言主要通过肠道GLUT吸收转运。Duehlmeier等［20］研究比较了GLUT1和GLUT4在单胃杂食动物（鼠、猪）和复胃草食动物（牛、山羊）骨骼肌中的分布方式，试验结果发现，两类动物GLUT1在氧化型和酵解型肌肉中的表达方式存在差异。这揭示品种间遗传差异是影响GLUT1在肌肉中表达方式的主要原因之一。本试验发现同日龄蓝塘和长白猪骨骼肌GLUT1 mRNA表达丰度发育变化存在相似的趋势，这进一步佐证了GLUT1在肌肉中的表达受品种间遗传差异的影响。本试验结果还发现，与长白猪相比，蓝塘猪背最长肌GLUT4的表达不受发育变化的影响，这也是由于品种的遗传差异所致。

此外，本试验发现同日龄蓝塘猪和长白猪骨骼肌GLUT1和GLUT4 mRNA在不同生理阶段存在不同程度的差异。本试验中150日龄时蓝塘猪半肌腱GLUT1和GLUT4相对表达丰度高于同日龄长白猪，且有文献报道肌内脂肪沉积主要在生长发育后期［21］，而蓝塘猪相比外来猪，其肌内脂肪含量较高，因此，我们推断葡萄糖可能是肌内脂肪沉积的主要能量来源和底物。

3.3IR与GLUT的发育性表达

动物细胞葡萄糖跨膜吸收在调节机体葡萄糖稳态方面起着十分重要的作用，而胰岛素调节GLUT活性对机体葡萄糖的代谢利用起着重要的生理作用。在基础代谢状态下，位于细胞膜上的GLUT4只有5%左右。然而，在胰岛素的快速刺激下（2～3 min），GLUT4外分泌增加，大约50% GLUT4重新移至细胞膜表面［22］。因此GLUT4易位是骨骼肌糖代谢的关键步骤。

基础状态下，骨骼肌的GLUT4主要于细胞内以囊泡形式存在，只有少数存在于细胞膜上。当组织受到胰岛素或运动的刺激时，胰岛素与其特定的IR结合，通过一系列的信号传导通路，触发富含GLUT4的小泡以胞吐的形式向细胞表面转位，促进葡萄糖的摄取，从而增加葡萄糖的转运，维持机体内葡萄糖的稳态［23-26］。本试验发现IRmRNA相对表达丰度主要在出生1和30日龄时出现高峰期，这可能与其生理需求有关，出生和断奶应激仔猪表现出高水平的胰岛素敏感性，进而使IR高度表达，这样有助于加快骨骼肌GLUT4跨膜转运，从而促进葡萄糖转运进入肌细胞，满足骨骼肌的能量代谢需要，进而维持血糖平衡。

正常的GLUT4表达依赖于正常的胰岛素水平和胰岛素敏感性。体外试验表明，胰岛素孵育骨骼肌，GLUT4 mRNA表达增加25%［27］。胰岛素敏感性缺乏的动物出现GLUT4转录水平的抑制，其原因可能在于调控区域的活性下降。Seraphim等［28］研究发现12月龄肥胖鼠发生胰岛素耐受现象，其脂肪组织GLUT4 mRNA和蛋白均显著低于2月龄正常小鼠，而肌肉中GLUT4 mRNA显著增加，GLUT4蛋白水平没有发生改变，这可能与GLUT4 mRNA poly（A）尾巴减少约80个A碱基有关。本试验中蓝塘和长白猪3个部位骨骼肌GLUT4 mRNA相对表达丰度高峰期均未表现出与IR一致，这揭示了GLUT4相对表达丰度的高低并不能完全反映出胰岛素敏感性。

4 结 论

①不同品种猪骨骼肌GLUT1 mRNA的表达存在相似的发育变化规律，GLUT4 mRNA的表达存在显著差异。

②不同生理阶段猪骨骼肌GLUT1、GLUT4以及IRmRNA的表达均存在差异。刚出生时猪骨骼肌GLUT1 mRNA的相对表达丰度显著高于其他生理阶段，而IRmRNA的相对表达丰度在出生和断奶时相比其他生理阶段更高。

③猪骨骼肌GLUT4 mRNA与其IRmRNA的表达不具有完全的一致性，仅在仔猪断奶时两者的表达均处于较高水平，IR高度表达使GLUT4表达升高可能与胰岛素信号传导通路有关。

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Ontogenetic Regulation of Glucose Transporter and Insulin Receptor mRNA Expression in Skeletal Muscle of Different Kinds of Pigs at Different Physiological Stages

LIU Wenzuo ZUO Jianjun DAI Fawen YE Hui CAO Qingyun ZHOU Xiangyan ZOU Shigeng HUANG Zhiyi ZHI Aimin FENG Dingyuan∗
（College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou510642，China）

This experiment was conducted to determine the ontogenetic regulation of glucose transporter（GLUT）1，GLUT4 and insulin receptor（IR）mRNA expression in skeletal muscle of different kinds of pigs at different physiological stages.Lantang（LT）and Landrace（LD）pigs at the age of 1，7，30，60，90 and 150 days were selected to determine the expression patterns ofGLUT1 andGLUT4 at different skeletal muscle tissues including longissimus dorsi muscles（LM），semimembranosus muscles（SM）and semitendinosus muscles（SD）by the method of real-time semiquantitative PCR for cDNA templates.The results showed as follows：1）LT and LD pigs exhibited similar development of mRNA expressions ofGLUT1 in the LM，SM and SD from 1 to 150 days of age with the highest level at the age of 1 day.2）LT and LD pigs exhibited waveform variations of mRNA relative expression abundance ofGLUT4 from 1 to 150 days of age with breed differences in the speed and extend of variations.At the age of 1 and 150 days，the mRNA relative expression abundance ofGLUT4 in the LM of LT pig was lower than that of LD pig with the same age（P＞0.05），while was higher than that of LD pig with the same age of the rest days（P＞0.05）.3）LT and LD pigs exhibited higher level of the mRNA relative expression abundance ofIRin the LM，SM and SD at the age of 1 and 30 days，while there were not significant difference among 7，60，90 and 150 days of age（P＞0.05）.There was no significant difference in mRNA relative expression abundance ofIRbetween LT and LD pigs with the same ages（P＞0.05）.The results suggest thatGLUT1 mRNA expression in skeletal muscles of pigs can be regulated by physiological stages，whileGLUT4 mRNA expression is not only differentially regulated by breeds but also differentially distributed in physiological stages，and the expression level ofGLUT4 is weakly related to theIRmRNA expression and shows no apparent rules.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：605-612］

pigs；physiological stages；glucose transporter 1；glucose transporter 4；insulin receptor；ontogenetic regulation

S828

A

1006-267X（2017）02-0605-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.029

（责任编辑 田艳明）

2016-07-28

国家重点基础研究发展计划项目（2012CB124701）；广东省科技计划项目（2016A020210104）；广州市科技计划项目（201510010258）

刘文佐（1991—），男，湖北仙桃人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。E-mail：lwz698631＠sina.com

∗通信作者：冯定远，教授，博士生导师，E-mail：fengdy＠scau.edu.cn

∗Corresponding author，professor，E-mail：fengdy＠scau.edu.cn