饲粮营养限制对羔羊肠道组织形态以及血清胰岛素样生长因子-1和胰高血糖素样-2浓度的影响

祁敏丽刁其玉马铁伟柴建民王 波崔 凯王 杰张乃锋∗

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081；2.南京农业大学，南京 210000）

饲粮营养限制对羔羊肠道组织形态以及血清胰岛素样生长因子-1和胰高血糖素样-2浓度的影响

祁敏丽1刁其玉1马铁伟2柴建民1王 波1崔 凯1王 杰1张乃锋1∗

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081；2.南京农业大学，南京 210000）

本试验旨在研究饲粮营养限制对羔羊肠道组织形态及血清中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和胰高血糖素样-2（GLP-2）浓度的影响。选取64只17日龄湖羊羔羊随机分为4组，饲喂不同营养水平的代乳品和开食料，分别为对照（CON）组、20%蛋白质限制（PR）组、20%能量限制（ER）组、20%蛋白质+20%能量限制（BR）组，每组4个重复，每重复4只羔羊，公母各占1/2。于羔羊20日龄、40日龄和60日龄采集血清用于测定IGF-1和GLP-2的浓度，40日龄和60日龄时每组分别选取4只羔羊进行屠宰，屠宰后取十二指肠、空肠和回肠组织观察小肠组织形态结构。结果表明：1）PR组、ER组、BR组40日龄小肠重量显著低于CON组（P＜0.05），到60日龄仅ER组羔羊小肠重显著低于CON组（P＜0.05），小肠重量降低主要由于空肠重量的降低。2）PR组、ER组、BR组40日龄十二指肠、空肠绒毛高度及60日龄十二指肠绒毛高度显著低于CON组（P＜0.05），ER组、BR组60日龄空肠绒毛高度显著低于CON组（P＜0.05）。3）BR组40日龄十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著低于CON组（P＜0.05）。4）ER组60日龄血清GLP-2浓度显著低于其他3组（P＜0.05），4组间血清IGF-1浓度无显著差异（P＞0.05）。综上所述，饲粮营养限制抑制了羔羊十二指肠、空肠组织形态发育，同时能量限制可降低血清GLP-2的浓度。

羔羊；营养限制；组织形态；胰岛素样生长因子-1；胰高血糖素样-2

小肠是反刍动物主要的吸收器官，其黏膜结构的正常发育是营养物质消化吸收和反刍动物正常生长发育的生理基础。肠道组织重量占机体体重5%～7%，却需要消耗个体所需营养物质的15%～20%［1］。营养不足可导致肠道组织结构和功能发生程序化改变［2］。研究表明，能量、蛋白质40%限制可降低羔羊小肠重量、限制黏膜发育［3］，妊娠期母羊40%营养限制可降低后代羔羊小肠重量、绒毛高度［4-5］。 而胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是细胞增殖促进因子，胰高血糖素样-2（GLP-2）是肠上皮细胞特异性促进因子。研究表明，初乳或饲粮中添加IGF-1或GLP-2可促进新生反刍动物小肠组织形态发育［6-7］，营养限制可降低血清中 IGF-1、GLP-2的浓度［3］及肠上皮细胞IGF-1、GLP-2基因的表达量［7］，同时可限制小肠黏膜的发育。当前有关营养限制对羔羊肠道组织形态发育的影响报道较少且多以放牧（或放牧补饲）羔羊、妊娠母羊为研究对象。湖羊作为我国多胎绵羊品种之一，通常每胎可产2～3羔，因此母乳难以满足待哺乳羔羊的营养需要；而0～2月龄是羔羊出生后肠道发育的快速时期，鲜有报道营养限制对0～2月龄羔羊肠道组织形态发育的影响。因此，本试验研究能量和蛋白质限制对0～2月龄羔羊小肠组织形态以及血清IGF-1、GLP-2浓度的影响，以期补充饲粮营养限制对羔羊肠道发育的影响，为湖羊羔羊早期饲养管理提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验采用随机试验设计，试验因素为整体饲粮（代乳品和开食料）中的营养水平。选取64只出生日期、初生重相近［（2.5±0.2）kg］、体况良好的（17±1）日龄纯种湖羊羔羊［体重（6.2± 0.2）kg］，随机分为4组，每组4个重复，每重复4只羔羊，公母各占1/2，每重复羔羊在1个栏位饲喂。其中，对照（CON）组饲喂基础饲粮，在CON组饲粮基础上分别对代谢能进行20%限制（ER组），粗蛋白质进行20%限制（PR组），或同时对代谢能和粗蛋白质进行20%限制（BR组）。17～19日龄为预试期，20日龄进入正试期，直至羔羊60日龄。

参照杨诗兴等［8］推荐的10 kg体重、平均日增重为300 g的湖羊营养需要量设置CON组营养水平，并相应设置ER组、PR组和BR组营养水平。试验饲粮包括代乳品和开食料。以本实验室研究结果确定 CON组代乳品营养水平（代谢能20 MJ/kg，粗蛋白质24%）［9］，然后根据营养需要和代乳品营养水平确定开食料中的代谢能和粗蛋白质水平。羔羊代乳品由北京精准动物研究中心提供，其营养水平见表1。CON组羔羊自由采食开食料，PR、ER、BR组羔羊开食料饲喂量参照CON组前1 d采食量进行饲喂，保持所有试验组羔羊具有相近的采食量。开食料为颗粒饲粮（直径4 mm，长度10 mm），自行配制，开食料组成及营养水平见表2。

表1 代乳品营养水平（干物质基础）Table 1 Nutrient levels of milk replacers（DM basis） %

表2 开食料组成及营养水平（干物质基础）Table 2 Composition and nutrient levels of starters（DM basis） %

续表2

1.2 饲养管理

试验羔羊17日龄之前随母哺乳，17日龄开始由随母哺乳逐渐过渡为饲喂代乳品，到20日龄羔羊完全断掉母乳改为饲喂代乳品，在21～50日龄和51～60日龄期间，代乳品的饲喂量分别以羔羊体重的2.0%和1.5%为标准。21～30日龄每日饲喂3次（08：00、12：00、18：00），31～60日龄每日饲喂2次（09：00、18：00）。同时试验羔羊于17日龄开始补饲开食料。试验羔羊于试验前打好耳号，按照羊场日常程序进行免疫。羊舍为半开放式暖棚，通风良好，每隔半月带羊消毒1次（0.5%百毒杀、0.1%新洁尔灭）。

1.3 样品采集与测定方法

1.3.1 代乳粉及开食料采食量及营养水平

准确称量并记录羔羊代乳品的采食量。开食料饲喂前准确记录羔羊的投料量和前1 d的剩料量，计算羔羊采食量，并采集饲料样和剩料样。代谢能使用Parr-6400氧弹量热仪测定；粗蛋白质含量采用KDY-9830全自动凯氏定氮仪测定；干物质、粗脂肪、粗灰分、粗纤维及钙、磷含量参考《饲料分析及饲料质量检测技术》［12］测定。

1.3.2 肠道组织形态

于羔羊40日龄和60日龄时每重复选取健康、接近平均体重的 1只羔羊进行屠宰，公母各占1/2。屠宰后迅速分离小肠各段，去除内容物洗净，称取各段肠道重量。从十二指肠、空肠、回肠中间部位取2 cm，组织固定液（40%甲醛120 mL，蒸馏水 880 mL，NaH2PO4·H2O 4 g，Na2HPO413 g）中充分固定，常规酒精脱水后石蜡切片包埋，切片厚度6 μm。经苏木精-伊红（HE）染色后在光镜下观察小肠的黏膜形态结构。采用Image-Pro Express图像分析处理系统，每个样品观察3张不连续性切片，测量视野中最长的绒毛高度（villus height，V）、隐窝深度（crypt depth，C），每张切片中至少选取5个视野进行计量，测量后计算出平均值作为测定数据。

1.3.3 血清胰岛素样生长因子（IGF-1）和胰高血糖素样肽（GLP-2）浓度

在羔羊 20日龄、40日龄和 60日龄晨饲（09：00）前进行颈静脉采血，所采集血液置于含有二氧化硅的促凝管内，静置30 min后以离心力1 358×g离心15 min，收集血清，-20℃保存待测。IGF-1和GLP-2浓度采用羊酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒［卡迈舒（上海）有限公司］测定，严格按照说明书操作。

1.4 统计方法

试验数据经过Excel处理后，采用SAS 8.1统计软件进行分析，使用ANOVA模型进行统计分析，差异显著使用Duncan氏法进行多重比较。所有数据均以P＜0.05作为差异显著判断的标准。

2 结果与分析

2.1 饲粮营养限制对羔羊生长性能和采食量的影响

从表3可以看出，PR组、ER组和BR组羔羊21～40日龄和 41～60日龄的平均日增重低于CON组（P＜0.05）。各阶段，4组羔羊代乳品采食量一致，开食料采食量差异不显著（P＞0.05）。PR组羔羊代谢能采食量与CON组差异不显著（P＞0.05），ER组、BR组显著低于CON组（P＜0.05），同时PR组、BR组羔羊粗蛋白质采食量显著低于CON组（P＜0.05），ER组与CON组差异不显著（P＞0.05）。平均日增重和采食量结果符合试验设计要求。

表3 饲粮营养限制对羔羊生长性能和采食量的影响Table 3 Effects of dietary nutrition restrictions on growth performance and feed intakes of lambs

2.2 饲粮营养限制对羔羊肠道重量的影响

从表4可以看出，PR组、ER组和BR组羔羊40日龄空肠、小肠重量显著低于 CON组（P＜0.05），十二指肠、回肠重量4组间无显著性差异（P＞0.05）。ER组羔羊60日龄空肠、回肠和小肠重量显著低于CON组、PR组、BR组（P＜0.05）。

2.3 饲粮营养限制对羔羊肠道组织形态的影响

从表5可以看出，PR组、ER组、BR组40日龄十二指肠、空肠绒毛高度及60日龄十二指肠绒毛高度显著低于CON组（P＜0.05），ER组、BR组60日龄空肠绒毛高度显著低于 CON组（P＜0.05），40日龄和60日龄回肠绒毛高度组间无显著性差异（P＞0.05）。十二指肠隐窝深度在40日龄时4组间无显著性差异（P＞0.05），到60日龄ER组、BR组显著低于CON组（P＜0.05），同时BR组显著低于PR组（P＜0.05）。

PR组、ER组、BR组空肠隐窝深度在2个日龄阶段均显著低于CON组（P＜0.05），ER组、BR组40日龄回肠隐窝深度显著低于 CON组（P＜0.05），PR组、ER组、BR组60日龄回肠隐窝深度显著低于CON组（P＜0.05）。PR组、BR组、ER组40日龄十二指肠绒毛高度/隐窝深度（V/C）显著低于CON组（P＜0.05），其他各组40日龄、60日龄各肠道组织间无显著性差异（P＞0.05）。

表4 饲粮营养限制对羔羊小肠重量的影响Table 4 Effects of dietary nutrition restrictions on small intestine weight of lambs g

表5 饲粮营养限制对羔羊小肠组织形态的影响Table 5 Effects of dietary nutrition restrictions on morphology of small intestine of lambs

羔羊空肠绒毛形态见图1。CON组羔羊空肠绒毛外形纤细呈现指状，发育良好，PR组羔羊空肠绒毛出现黏连，形状不规则，而ER组、BR组空肠绒毛上皮脱落严重，形状不规则。

2.4 饲粮营养限制对羔羊血清 IGF-1、GLP-2浓度的影响

从表6可以看出，4组羔羊血清IGF-1浓度差异不显著（P＞0.05）。4组羔羊20日龄和40日龄血清GLP-2浓度差异不显著（P＞0.05），ER组60日龄血清 GLP-2浓度显著低于其他 3组（P＜0.05）。血清中 IGF-1和 GLP-2浓度随日龄增长显著降低（P＜0.05）。

图1 羔羊空肠绒毛形态Fig.1 Villas morphology of jejunum of lambs（40×）

表6 饲粮营养限制对湖羊羔羊血清IGF-1和GLP-2浓度的影响Table 6 Effects of dietary nutrition restrictions on concentrations of IGF-1 and GLP-2 in serum of lambs

3 讨 论

3.1 饲粮营养限制对羔羊肠道重量的影响

小肠重量每增加1 g就会使动物维持需要增加290～350 g/d［13］，当羔羊营养需要尤其是能量得不到满足时，机体减少内脏器官维持需要用于生长。本试验BR组降低了40日龄羔羊小肠重量，尤其是空肠重；但是60日龄羔羊小肠重量低于CON组，差异不显著。营养限制对小肠重量结果不一致的原因，可能是由于随着羔羊体重增加用于维持的营养物质增加，剩余的营养物质致使小肠增重不显著。Li等［14］研究表明，40%的蛋白质限制、20%的能量限制不会降低断奶羔羊小肠重量。不同的试验研究结果不一致可能是由于对照组羔羊营养水平设置不一致导致限制组营养水平不同，如本研究中相对于平均日增重300 g/d，而Li等［14］研究中相对于平均日增重145 g/d。降低反刍动物饲粮的能量水平，降低了植物蛋白质转化为瘤胃微生物蛋白质的效率，而高蛋白质植物饲粮含有抗营养因子易引起肠道损伤［15-17］。所以ER组小肠重量始终低于CON组，60日龄时显著低于BR组。王波等［18］研究中与本试验进行相同的饲养管理，采食80.58 g/d蛋白质的羔羊小肠重量显著低于采食117.82 g/d，与本试验PR组研究结果不一致。王波等［18］研究中，羔羊具有不同水平的采食量，而本试验中羔羊具有相同的采食量，因此，更加有力地证明了本试验中进行蛋白质限制不会引起小肠重量的改变。因此，相对于限制蛋白质，限饲能量更能够降低羔羊小肠重量，引起肠道损伤。

3.2 饲粮营养限制对羔羊肠道组织形态发育的影响

绒毛高度是细胞增殖的结果，绒毛高度增加可增加肠道吸收面积。研究表明，限制40%满足母羊正常需要的营养水平显著降低了母羊肠道绒毛高度、限制了后代羔羊肠道发育［19］；在放牧条件下增加补饲可以提高断奶犊牛的小肠绒毛高度，促进肠道发育［20］。本试验在满足羔羊平均日增重300 g/d基础上进行20%能量和蛋白质同时限制显著降低了羔羊十二指肠、空肠的绒毛高度，与Sun等［21］有一致的结果。 但是Sun等［21］研究中，蛋白质或能量限制对肠道绒毛高度无显著影响，与本试验结果不一致。出现结果不一致的原因，一方面可能是肠道组织形态发育受代谢类型的影响［22］，与羔羊品种有关；另一方面可能与瘤胃发育程度有关，Sun等［21］研究中瘤胃已发育成熟，本试验中羔羊瘤胃处于非反刍向反刍的过渡阶段，部分饲粮对肠道有直接刺激作用。蛋白质限制、能量限制降低肠道绒毛高度，主要是限制了小肠细胞的肥大和增殖，降低饲粮能量或蛋白质水平可以降低小肠组织钠，钾-ATP酶的活性［23-24］。钠，钾-ATP酶是主动跨膜转运钠钾离子的载体蛋白，其活性的升高可以促进正常细胞的肥大和增殖。

隐窝内的未分化细胞是肠腺和绒毛上皮细胞的再生来源，未分化细胞的数量及所在位置的深浅对于保持肠绒毛的完整形态和正常进机能有重要作用。Li等［14］报道对断奶羔羊进行营养限制降低了羔羊空肠隐窝深度。本试验中营养限制组羔羊小肠各段隐窝深度低于CON组，以BR组空肠段隐窝深度最低，这与Reed等［4］报道限制母羊妊娠期间营养水平可以显著降低出生羔羊空肠隐窝细胞面积和总蛋白质的合成有一致的结果。当肠道黏膜受到损伤时表现为绒毛变短，隐窝深度增加。本研究中可以发现，绒毛高度、隐窝深度有一致的变化，因此可以推测本试验中隐窝深度增加，可能是由于细胞增殖，细胞数量增多引起，但是这需要进一步研究。Montanholi等［25］认为，降低饲料转化率可以降低隐窝内细胞的数量。本研究中羔羊具有相近的采食量，且PR组、ER组、BR组羔羊饲料转化率低于CON组，以BR组最低，隐窝深度也以BR组最低。但是Sun等［21］报道对3月龄断奶羔羊进行48 d的40%营养限制（相对于平均日增重150 g/d）不会降低肠道隐窝深度，与本试验结果不一致，可能是由羊只品种、日龄、试验饲料原料以及饲养管理不同引起。V/C综合反映小肠的功能状态，比值下降表示消化吸收功能下降，常伴随腹泻的发生，比值上升表示消化吸收功能增强，腹泻率降低。本试验 BR组羔羊空肠V/C最低，观察发现BR组羔羊更容易发生腹泻。

3.3 饲粮营养限制对羔羊血清IGF-1浓度的影响

IGF-1在反刍动物的体液内广泛存在，它能促进机体、器官、组织的生长发育。研究表明，蛋白质和能量都会影响血清中IGF-1的浓度。闫云峰等［26］报道了饲粮蛋白质水平（15%、18%、21%）与血清IGF-1存在正相关，与Pell等［27］报道有一致结果。但是Sun等［2］报道能量限制、蛋白质限制不会降低断奶羔羊血清中IGF-1浓度，但是能量和蛋白质同时限制可显著降低血清中IGF-1浓度。本试验中营养限制降低了20日龄、40日龄、60日龄羔羊血清IGF-1浓度，差异不显著。饲粮营养不足的情况下，机体为了适应外界环境造成的影响，通过内分泌激素的分泌来调节动物的生长，主要是通过抑制生长抑素的分泌，增加生长激素的分泌，进而可以提高IGF-1的浓度。但是当营养限制严重时会降低肝脏生长激素受体（GHR）的表达，降低了IGF-1的分泌。本试验以及Sun等［2］试验中，能量限制组或蛋白质限制组中饲粮营养限制后的水平处于营养不足的情况，但是又不足引起肝脏GHR表达的降低，但同时进行能量和蛋白质限制可能会引起肝脏GHR基因表达量降低［28］。因此，营养限制不能引起羔羊血清中IGF-1浓度的降低。Lu等［29］报道研究表明，IGF-1参与上皮细胞增殖的过程。本试验中营养限制降低了羔羊肠道绒毛高度、隐窝深度，但是血清中IGF-1浓度无显著性差异，可能是由于IGF-1并不是唯一促进肠道组织形态发育的激素。

3.4 饲粮营养限制对羔羊血清GLP-2浓度的影响

IGF-1对维持肠道发育起重要作用，但并非是肠上皮细胞特异的，而GLP-2是肠上皮细胞特异性促进因子。研究表明，要维持GLP-2的正常分泌水平，胃肠道摄入的营养物质至少要占总摄入营养物质的 40%［30-31］。本试验中 ER组羔羊 60日龄血清GLP-2浓度显著低于CON组，但是40日龄时差异不显著。与王纯刚［32］在仔猪上的研究报道一致，饲粮短时间的改变对血清GLP-2浓度变化轻微，Górka等［33］研究表明，长期（29 d）保持较高浓度的采食量可增加血清中GLP-2的浓度。因此，短时间能量限制不会显著降低羔羊血清GLP-2的浓度。在大鼠［34］上研究可得GLP-2激素可以促进肠道黏膜损伤的修复，Jin等［35］认为断奶仔猪肠道绒毛高度与血清中GLP-2的浓度高度相关。观察肠道绒毛形态并结合肠道重量发现，ER组肠道绒毛脱落现象严重，绒毛较短，同时ER组羔羊小肠重量低于显著低于CON组，可以肯定羔羊小肠的发育与GLP-2浓度有关。本试验中营养限制抑制了肠道组织形态发育，但是仅ER组羔羊60日龄血清中GLP-2浓度低于CON组。因此，需要进一步研究营养限制对血清中GLP-2浓度的影响或对GLP-2基因表达量的影响，尤其是蛋白质限制。

4 结 论

① 营养限制降低了40日龄羔羊小肠重量，抑制了十二指肠、空肠组织形态的发育，以能量限制抑制最为严重。

②能量限制降低了羔羊60日龄血清GLP-2浓度，对血清IGF-1浓度无显著影响。

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Effects of Dietary Nutrition Restrictions on Intestinal Morphology and Serum Insulin-Like Growth Factor-1 and Glucagon-Like Peptide-2 Concentrations of Lambs

QI Minli1DIAO Qiyu1MA Tiewei2CHAI Jianmin1WANG Bo1CUI Kai1WANG Jie1ZHANG Naifeng1∗
（1.Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture，Beijing100081，China；2.Nanjing Agricultural University，Nanjing210000，China）

The aim of this study was to assess the effects of dietary nutrition restrictions on intestinal morphology and serum insulin-like growth factor-1（IGF-1）and glucagon-like peptide-2（GLP-2）concentrations of lambs.Sixty-four 17-day-oldHulambs were randomly divided into four groups with four replicates per group and four lambs per replicate（half male and half female），including control（CON）group，20%of protein restriction（PR group），20%of energy restriction（ER group），and 20%of energy+20%of protein restriction（BR group）.Serum sample was collected at 20，40 and 60 days of age to determine serum concentrations of GLP-2 and IGF-1.Four lambs of each group were slaughtered at 40 and 60 days of age，respectively，to observer morphological structure of duodenum，jejunum and ileum.The results showed as follows：1）the weight of small intestine was significantly reduced in PR，ER and BR groups compared with CON group at 40 days of age（P＜0.05），and was significantly reduced only in ER group compared with CON group at 60 days of age（P＜0.05）.2）Villus height of duodenum and jejunum at 40 days of age，and of duodenum at 60 days of age in PR，ER and BR groups was significantly lower than that of CON group（P＜0.05），villus height of jejunum at 60 days of age in ER and BR groups was significantly lower than that of CON group（P＜0.05）.3）Villus height/crypt depth（V/C）of duodenum at 40 days of age in BR group was significantly reduced compared with CON group（P＜0.05）.4）Serum concentration of GLP-2 was significantly reduced in ER group compared with the other groups at 60 days of age（P＜0.05），but serum IGF-1 concentration was not significantly differed in 4 groups（P＞0.05）.In conclusion，dietary nutrition restrictions reduce morphological development of duodenum and jejunum，and energy restriction reduces serum concentration of GLP-2 in lambs.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：426-435］

lamb；nutrition restriction；morphology；insulin-like growth factor-1；glucagon-like peptide-2

S826

A

1006-267X（2017）02-0426-10

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.009

（责任编辑 王智航）

2016-07-01

公益性科研专项＂南方地区幼龄草食畜禽饲养技术研究（201303143）；国家肉羊产业技术体系建设专项资金（CARS-39）

祁敏丽（1990—），女，河北保定人，硕士研究生，从事幼畜生理与营养研究。E-mail：minliqi＠yeah.net

∗通信作者：张乃锋，副研究员，硕士生导师，E-mail：zhangnaifeng＠caas.cn

∗Corresponding author，associate professor，E-mail：zhangnaifeng＠caas.cn