HPLC法测定健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量

孙永慧+赵静+孙楠

[摘要]目的 建立健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 以高效液相色谱法测定健腰通颗粒中黄芪甲苷的含量，采用Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min；柱温：40℃；蒸发光散射检测器参数中氮气流量：2.5 L/min；漂移管温度：105℃。结果 黄芪甲苷进样量在0.56～4.20 μg（r=0.9994）范围内线性关系良好。加样回收率为95.83%（RSD为1.39%，n=5）。结论 本含量测定法重复性和精密度良好，结果可靠准确，可作为该制剂质量的检测方法。

[关键词]健腰通颗粒；黄芪甲苷；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（c）-0140-03

[Abstract]Objective To establish the method for the determination of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules.Methods HPLC was used the quality of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules，analytical column was Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）.Mobile phase was Acetonitrile-Water（30∶70）.Flow rate was 1.0 ml/min，the parameter of ELSD detector：the flow rate of N2 was 2.5 L/min；the temperature of drift tube was 105℃.Results The linear range of astragaloside Ⅳ was from 0.56 to 4.20 μg（r=0.9994）.The average recovery was 95.83%（RSD=1.39%，n=5）.Conclusion This method is proved to be sensitive and reliable.It can be the quality detection method of Jianyaotong Granules.

[Key words]Jianyaotong Granules；Astragaloside Ⅳ；HPLC；Content determination

健腰通颗粒是由黄芪、鸡血藤、骨碎补、桑寄生、牛蒡子、补骨脂、三七、淫羊霍、水蛭、鹿茸等多种中药组成的复方制剂。具有疏筋养血，补肾益气，强腰健肾的功效。用于腰间盘突出，腰椎增生及颈腰综合症，具有良好的治疗效果。黄芪是该制剂中起主要作用的药物，本实验以高效液相色谱（HPLC）法对健腰通颗粒中黄芪甲苷进行了含量测定[1-14]，以控制该制剂的质量。

1仪器与试药

Waters 2695-2998型高效液相色谱仪（Waters公司，Empower工作站）；蒸发光散射检测器（Alltech 2000型，奥泰克公司）；BP221S型电子天平（德国赛多利斯公司）；健腰通颗粒（批号：20150301，20150302，2015 0303），由黑河市中医院制剂室生产；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201209）， 从中国药品生物制品檢定所购得。甲醇（色谱纯，迪马公司）；D101型大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所，批号：20140510）；三氯甲烷（天津化学试剂厂，批号：20150915）；正丁醇（天津化学试剂厂，批号：20151020）；氨水（天津化学试剂厂，批号：20151201）；无水乙醇（天津化学试剂厂，批号：20151208）；甲醇（天津化学试剂厂，批号：20150815）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱型号：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（30∶70）；流速为1.0 ml/min；蒸发光散射检测器参数中氮气流量：2.5 L/min；漂移管温度：105℃；柱温是40℃。此分离检测条件下，供试品中黄芪甲苷色谱峰与其它色谱峰分离度良好，基线平稳，阴性制剂无干扰，HPLC色谱图见图1。

2.2供试品溶液的制备

取健腰通颗粒（批号：20150301）3袋，粉碎，取粉末25 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流2 h。弃去三氯甲烷提取液，滤纸筒挥干三氯甲烷，再加甲醇适量，加热回流4 h。甲醇提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水20 ml，稍微水浴加热搅拌使溶解，室温放冷，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，40 ml/次。正丁醇提取液合并，用氨试液振摇洗涤2次，40 ml/次，弃去氨试液，正丁醇提取液蒸干，残渣加水10 ml使溶解。水液通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，装入树脂高12 cm），用水50 ml洗脱，弃去水洗脱液，再用40%乙醇30 ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并转移至5 ml量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，得健腰通颗粒待测供试品溶液。

2.3黄芪甲苷对照品溶液的制备

取黄芪甲苷对照品约3 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加色谱甲醇至刻度，振摇使溶解混匀，得每1 ml含0.28 mg的黄芪甲苷对照品溶液。

2.4线性关系的考察

取黄芪甲苷对照品溶液分别进样2、5、8、10、12、15 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量微克数的自然对数为横坐标，以黄芪甲苷色谱峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为：Y=1.6418 X+10.9741（r=0.9996），提示黄芪甲苷对照品的进样量在0.56～4.20 μg有良好的线性关系，可以用外标两点法进行含量测定。

2.5精密度试验

取黄芪甲苷对照品溶液，吸取5 μl，连续进样6次，测得黄芪甲苷对照品色谱峰面积的RSD值为1.97%，结果表明精密度良好。

2.6稳定性试验

取健腰通颗粒供试品溶液，在7个不同时间点进样测定，分别是：0、2、4、6、8、10、12 h，每次精密进样20 μl，结果健腰通颗粒的供试品溶液在12 h之内测定，黄芪甲苷峰面积数值是稳定的，RSD=2.56%。

2.7重复性试验

取同一批健腰通颗粒，粉碎后称取6份，每份约25 g，精密称定，按照“2.2”项下方法提取制备供试品溶液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5 μl、10 μl以及供试品溶液20 μl，按照前述色谱条件进样，测定，以外标两点法对数方程计算供试品中黄芪甲苷的含量。结果测得黄芪甲苷含量分别为0.0328、0.0336、0.0351、0.0343、0.0358、0.0353 mg/g，平均值为0.0345 mg/g（RSD=3.24%），结果显示本药含量测定方法有较好的重复性。

2.8加样回收率试验

取同一批健腰通颗粒供试品，粉碎，分别取细粉6份，每份约12.5 g，精密称定重量，在每份供试品细粉中分别加入黄芪甲苷对照品0.42 mg（精密吸取浓度为0.28 mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液1.5 ml），按照前述“2.2”供试品溶液制备项下的方法进行提取以及进行含量测定见表1。

五份健腰通颗粒供试品的平均加样回收率为94.79%（RSD=1.46%）。结果显示该药回收率较高，测定方法可靠。

2.9供试品测定

取三批健腰通颗粒（批号：20140901，20140902， 20140903）各3份，粉碎，每份取约25 g，精密称定重量，按照前面2.2项下供试品溶液制备方法操作，得到待测黄芪甲苷含量的健腰通颗粒供试品溶液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5、10 μl以及供试品溶液20 μl，按照前述方法进样、测定、计算供试品中黄芪甲苷的含量，见表2。

结果显示，三批健腰通颗粒中黄芪甲苷含量平均为0.0373 mg/g，按平均值80%制订健腰通颗粒中黄芪甲苷含量[15]，每克健腰通颗粒中黄芪甲苷含量应≥0.03 mg。

3讨论

本方中黄芪起主要作用，其主要成分为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷等，本试验通过测定该药中黄芪甲苷的含量来控制该制剂的质量。含量测定参考《中国药典》2015年版一部“黄芪”药材[含量测定]项下的方法[1]，并参考文献[2-14]，采用高效液相色谱-蒸发光散射法进行测定，根据实际色谱分离效果调整流动相乙腈-水的比例，在乙腈-水（30∶70）时黄芪甲苷色谱峰分离度良好，保留时间适宜，且阴性对照无干扰，是该制剂黄芪甲苷含量测定最优的色谱条件。

蒸发光散射检测器用于测定黄芪甲苷的含量，重复性、灵敏度、稳定性均能符合含量测定的要求。本试验对漂移管温度、雾化器温度、流动相流速以及载气流速等试验参数进行了研究试验、优化调整。本试验的最终优化条件：流动相为乙腈-水（30∶70），流速为1.0 ml/min，柱温为40℃，蒸发光蒸发温度为105℃，载气（氮气）流速为2.5 L/min。

综上所述，本黄芪甲苷含量测定方法快速、灵敏、简便，精密度、线性、重复性、稳定性以及加样回收率均符合要求，结果准确可靠，重复性好，可用于健腰通颗粒的质量控制。

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（收稿日期：2016-08-29 本文编辑：顾雪菲）