猪日本乙型脑炎的PCR诊断

秦洁

（新乡县农牧局，河南新乡453000）

猪日本乙型脑炎的PCR诊断

秦洁

（新乡县农牧局，河南新乡453000）

日本乙型脑炎病毒（JEV）是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属成员，也是一种重要的人兽共患病病原，可感染人和猪、马、牛、羊、鼠、犬及禽类等多种动物，以流行性乙型脑炎为主的急性传染病。其中，猪是日本乙型脑炎病毒的主要易感动物之一。猪感染日本乙型脑炎病毒主要表现为繁殖障碍和脑炎，临床上以妊娠母猪发生流产，产死胎、木乃伊胎，公猪睾丸肿大为特征，脑炎症状多由感染的仔猪表现。笔者将一例猪感染日本乙型脑炎病毒的PCR诊断进行报道，以供参考。

1 临床病例

2016年7月份至8月份，一小型养猪场陆续有14头妊娠母猪发生流产，除偶有胎衣不下外，未见其他明显的临床症状。采集流产病猪和胎儿的主要脏器、睾丸、腹股沟淋巴结及胎衣送到新乡县进行布鲁氏菌、衣原体、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等与流产相关的病原检测。

2 实验室诊断

2.1 病料的DNA和RNA提取

将采集的病料组织加液氮充分研磨。取部分研磨好的样品进行总DNA的提取，样品以500 μl DNA提取液（10%SDS，20 mg/ml蛋白酶K）在56℃水浴中消化2 h是样品完全裂解，加入等体积酚/氯仿/异戊醇萃取2次，上清中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠，于-80℃冰箱中2 h沉淀DNA，12 000 r/min离心30 min，弃上清，所得白色沉淀即为DNA，晾干，加100 μl TE缓冲液溶解DNA，保存备用。取部分研磨好的样品进行总RNA的提取，样品以1 000 μl溶解TRizol，离心，上清加等体积氯仿充分混匀，离心去上清，重复此步骤一次，所得上清中加入异丙醇，于-80℃冰箱中沉淀RNA，12 000 r/min离心30 min，弃上清，所得白色沉淀即为RNA，晾干，加RNase free H2O溶解RNA，常规方法反转录为cDNA备用。

2.2 PCR检测

布鲁氏菌、衣原体和猪细小病毒的基因组为DNA，PCR检测时以所提取的DNA为模板，日本乙型脑炎病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的基因组为RNA，PCR检测时以反转录所得的cDNA为模板。以Takara Premix Taq™（Ex Taq™Version 2.0 plus dye）预混酶进行扩增，50 μl PCR反应体系含25 μl Premix Taq，2 μl模板，2 μl相应的上下游检测引物，21 μl H2O。本试验检测日本乙型脑炎病毒所用引物为P1：5’-GATCTGGTGTTAGAAGG AGA-3’；P2：5’-TCACAATCCAGTGTGACTTC-3’。PCR反应条件为95℃预变性后，94℃变性45 s，52～57℃退火45 s，72℃延伸45 s，设35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3 结果

将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，仅日本乙型脑炎病毒核酸阳性，在510 bp处有一条特异性目的条带，而布鲁氏菌、衣原体、猪细小病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的PCR结果均为阴性，这表明该猪场的母猪流产由猪日本乙型脑炎病毒感染引起。

4 讨论

日本乙型脑炎又称流行性乙型脑炎，是由日本乙型脑炎病毒感染引起的以中枢神经系统病变为主要特征的人兽共患传染病。日本乙型脑炎属于自然疫源性疾病，具有一定的季节性和区域性，与蚊的活动有密切关系，主要发生在蚊虫较多的6～9月间。人和多种动物对日本乙型脑炎病毒均易感，人被感染发生乙型脑炎。牛、羊和禽类在多数情况下为隐性感染，不表现明显临床症状。马感染后多表现脑炎症状，而猪主要表现为流产、死胎和睾丸炎等。猪被认为是日本乙型脑炎病毒最重要的天然宿主，通过猪—蚊—猪的流行环节在动物间循环。因此，猪日本乙型脑炎是一种威胁人畜健康的常见传染病。

由日本乙型脑炎病毒感染引起的猪群繁殖障碍在我国规模化养殖场中比较常见。以流产为主要特征的猪日本乙型脑炎可根据该病的流行病学特点和临床症状进行初步诊断，但需要与常见的可引起流产相关的病原如布鲁氏菌、衣原体、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等进行区分。猪日本乙型脑炎的流行呈明显的季节性，而猪布鲁氏菌病、衣原体、伪狂犬病、猪细小病毒病等没有流行的季节性；猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染的猪群除母猪发生流产、早产、死产和产木乃伊胎外，断奶前仔猪表现呼吸道综合征，新生仔猪死亡率很高；圆环病毒与之类似，对发病猪群中的仔猪影响很大。猪场发病时，可用血清学或分子生物学方法对上述病原进行诊断。笔者对发病猪场采集的样品进行了布鲁氏菌、衣原体、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的PCR检测，发现所采集的病料中日本乙型脑炎病毒核酸为阳性，而其他病原的核酸为阴性。由于猪场的流产时节正值蚊虫活跃，猪日本乙型脑炎的流行期，结合临床症状，可以断定该发病猪场的流产病例为猪日本乙型脑炎。

猪日本乙型脑炎目前尚无特效的治疗药物。在防控方面，猪发病时应及时隔离，根据临床症状进行对症治疗，以防止继发感染。蚊虫既是日本乙型脑炎病毒的传播媒介，也是病毒的贮存宿主，因此可通过杀灭蚊虫来阻断其传播途径进行该病的预防。加强饲养管理，保持猪场的环境卫生，疏通沟渠，及时排除积水和污水，消除蚊虫孳生地，定期消毒等。另外，给猪群定期免疫接种可有效预防和控制该病。一般对后备公猪和母猪在当地乙型脑炎流行季节前1～2个月，按量接种日本乙型脑炎病毒弱毒疫苗，接种后1个月可产生免疫保护力。以后则按常规每年注射1次，有较好的预防效果。

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1004-5090（2017）08-0045-01

2017-06-11）