柑橘黄龙病检测及治疗方法的研究进展

陈文利， 徐 婉 ， 程保平， 彭埃天， 焦 悦

(1. 华南师范大学生物光子学研究院， 教育部重点实验室激光生命研究所， 广州 510631；2. 广东省农业科学院植物保护研究所， 广东省植物保护新技术重点实验室， 广州 510640)

柑橘黄龙病检测及治疗方法的研究进展

陈文利1*， 徐 婉1， 程保平2， 彭埃天2， 焦 悦1

(1. 华南师范大学生物光子学研究院， 教育部重点实验室激光生命研究所， 广州 510631；2. 广东省农业科学院植物保护研究所， 广东省植物保护新技术重点实验室， 广州 510640)

黄龙病是柑橘产业中的一种毁灭性病害，近年来该病害在全球多个柑橘产区爆发，对研究者和生产者带来巨大挑战. 目前认为柑橘黄龙病病原是一种迄今无法分离、培养的候选韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌. 虽然目前已经开发了多种治疗黄龙病的方法，但都只能延缓黄龙病的症状，仍然缺乏有效的根治黄龙病的手段. 本文对近几年来黄龙病的传播途径、检测方法以及治疗方法进行概述，并对今后在纳米包裹质粒和药物联合起来治疗黄龙病的研究方向进行了展望.

黄龙病； 传播途径； 检测方法； 治疗方法

Keywords： Huanglongbing (citrus greening disease); mode of transmission; detection technology; treatment technology

柑橘生产是世界上最重要的农业经济活动之一. 柑橘类水果是世界上产量最大的4类水果之一. 近年来柑橘生产的经济损失主要是由黄龙病(Huanglongbing，HLB or crtius greening disease)造成. 柑橘感染黄龙病后，先在浓绿的树冠中出现少数黄梢，以后黄梢数量不断增加，叶片则表现均匀黄化、黄绿相间的斑驳或缺锌症状，新树感染该病后1～2年内衰亡，老树感病后3～5年内衰亡，橘园发病后2～3年内，可完全丧失生产能力，给柑橘产业带来致命性的打击. 目前普遍认为黄龙病的病原为α-薄壁菌门、变型菌纲的候选韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌[1-2]. 韧皮部杆菌属包括3个与黄龙病相关的种：亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus,Las)、非洲种(CandidatusLiberibacter africanus,Laf)和美洲种(CandidatusLiberibacter americanus,Lam)[3-4].

世界上最大的柑橘生产国如中国、巴西、印度、墨西哥和美国都受到黄龙病的威胁. 我国最早发现黄龙病可以追溯到18世纪70年代的广东潮汕地区. 而印度从18世纪即发现类似黄龙病症状的柑橘黑死病[5-6]，因此这种疾病在亚洲的存在可能已经超过100年了. 2004年在巴西的圣保罗洲发现了黄龙病[7]， 2005年在美国的佛罗里达州也发现这种疾病[8]. 黄龙病对柑橘具有毁灭性的危害. 黄龙病不但具有较长的潜伏期，而且到目前为止也无法培养出任何黄龙病菌，同时也缺少已知的商业抗病品种. 这对研究者、管理机构以及柑橘产业带来了巨大的挑战. 本文对近几年来黄龙病的传播途径，检测方法以及治疗方法进行概括，提出运用纳米材料转基因及药物包埋药物用于黄龙病治疗的设想，希望能推动柑橘黄龙病的治疗进程.

1 传播途径

目前所知的黄龙病病菌传播方式是嫁接传播、昆虫媒介传播和菟丝子传播.

黄龙病菌可通过嫁接传播. 王芝生等[9]的研究表明，不同嫁接组织传病的成功率不同(多芽枝端>单芽枝段>无芽枝段>枝皮)，赵学源等[10]的研究表明不同时期的嫁接苗木染病的几率也存在差异：5—7月嫁接的苗木发病率较其它时间低. 2009年，LOPES等[11]用美洲种和亚洲种黄龙病病菌单独侵染和复合侵染植株后，通过PCR和qPCR检测植株的传病率和携菌量发现：亚洲种的传毒率显著性高于美洲种，这可能是亚洲种发生频率高于美洲种的原因之一.

木虱是一种重要的黄龙病传播的昆虫媒介. XU等[12]通过田间观察发现：广东和福建的种植园中有高达70%的柑橘树感染了黄龙病. 该病是通过木虱的第四和第五龄木虱若虫传播，而不是通过第一、二、三龄若虫传播. 他们还发现：成年木虱至少在染病植株上培养5 h即可传毒. 单个木虱生活史中可发生高达13次的传毒. 每个昆虫至少可传播一个植株，10个成年木虱对一棵植株传毒仅需要2天. 然而，INOUE等[13]的实验中，通过成年木虱取食感染植物却都没有传毒；PELZ-STELINSKI 等[14]的实验结果表明，取食感染时间的增加对传毒效率没有什么影响. 结合后2种实验观点，木虱在不同发育阶段具有不一样的传播黄龙病的能力这个观点被推翻了.

木虱经卵传播病原菌这种途径也争论了好久. 早在1992年VAN DEN BERG[15]就已经提到了这种传播方式. MANN等[16]在2011年也发现了木虱传播黄龙病是经卵传播的. 2015年LEE等[17]发现：成年木虱在若虫期间感染了病菌，随着若虫的出生，若虫也被细菌感染，之后细菌在木虱体内扩增. 当木虱从若虫变为成虫后，它们继续重复这个过程. 在条件适宜的时候雌木虱的平均产卵在748个，因此潜在阳性木虱的增加量是非常巨大的.

柑橘黄龙病菌还可以通过冤丝子(C.campestris和C.australis)从柑橘传到柑橘或长春花，约3个月的时间就能在长春花上观察到黄龙病引起的黄化症状[18].

柑橘黄龙病，由于其病原菌及传播途径的特殊，目前没有较好的解决此问题的有效方法，寻找一些新的针对此病的防治方法，非常紧迫. 笔者认为可从以下几个方面进行深入研究：筛选和培育抗黄龙病的基因型，加快抗病新品种的研究；进一步深入研究其病原、发病机理及其流行病学规律，筛选、发明针对根治黄龙病的有效杀菌药剂及抗原；针对柑桔木虱的传播途径，研究其天敌生物资源.

如果能在传播途径上，利用纳米转基因和药物包埋技术处理控制黄龙病的传播，那将是一个值得研究的好课题.

2 黄龙病检测方法

黄龙病的检测方法主要分为田间症状诊断、电镜观察、血清鉴别法，淀粉-碘检测法、高光谱检测技术和PCR检测法. 田间症状诊断相对简单、快捷，但是结果却并不准确；电镜观察法检测准确度不高；就目前来说，比较流行的检测方法有分子检测法和高光谱检测法.

2.1 分子检测法

近年来常用的疾病检测分子技术是ELISA，PCR和qPCR；其他分子技术包括免疫荧光(Immunofluorescence，IF)、流式细胞术、荧光原位杂交(Fluorescence in Situ Hybridization，FISH)和DNA微阵列[19]. 目前，植物病害的PCR技术检测已经较为成熟，有2种PCR系统已被用于黄龙病的检测. 第一种是基于16S rDNA序列的PCR系统，这种系统使用许多引物和探针序列[20]. 引物对OI1和OI2c能够扩增16S rDNA Las和Laf物种[21]. 序列分析表明，Las扩增的16S rDNA具有一个XbaI限制性位点，在XbaI处理时产生2个大小为520、640 bp的片段. 来自Laf扩增的16S rDNA具有额外的限制性位点，产生3个片段，分别为520、506、130 bp[21-22]. 第二种PCR方式以n-gpr操纵子区(引物对A2，J5以及引物对MHO353，MHO354)为中心[20]. 基因rplA和rplJ之间的基因间区域在Las中比在Laf中大34 bp. 如果2种韧皮部杆菌属存在于同一个样品中，使用rplA基因中选择的正向引物f-rpl A2和来自rplJ基因的反向引物r-rpl J5，能从Las中扩增出一个703 bp的DNA，而Laf中则获得669 bp的DNA[23]. 目前，qPCR是比较受欢迎的检测黄龙病菌的方法[24]. 与传统的PCR技术相比，qPCR提供了更加敏感快捷的检测病原菌的方法. 相对于巢式PCR，qPCR敏感度提高了检测韧皮部杆菌10～100倍；而相对于传统的PCR，qPCR检测病菌的敏感性提高了100～1 000倍[25]. KIM 和WANG 等[26]使用引物探针靶向16S rDNA和β操纵子DNA比较了不同检测黄龙病的qPCR方法. 在Las菌种中，16S rDNA 的数量是β操纵子DNA的3倍，因此可以用来检测黄龙病. 定量反转录酶PCR(Quantitative Reverse Transcriptase PCR，qRT-PCR)实验表明，RT-PCR能够通过靶向16S rRNA增加检测的灵敏度.

GOPAL等[27]用对rDNA区域具有特异性的引物进行PCR，成功从具有黄龙病症状的甜橙中扩增出了1 160 bp DNA片段，而从健康的甜橙植物中没有扩增出来. 之后利用生物素标记1 160 bp的PCR产物作为一种探针，在核酸斑点杂交检测中检测黄龙病病菌，甚至把黄龙病感染的组织进行100倍的稀释后，黄龙病病菌依然可以被检出来. 他们把从HLB感染的组织中提取的总DNA稀释后点在硝酸纤维素膜上，当DNA稀释到225 ng时具有高强度信号，而稀释到112 ng时为中等信号. 在健康样品中没有观察到杂交信号，而在阳性对照中观察到了强烈的信号.

2.2 高光谱检测法

利用高光谱技术检测黄龙病也是目前一种比较流行的检测方法. HAWKINS[28]等利用傅里叶变换红外衰减全反射光谱将患病柑橘叶子与正常未感染的叶子进行比较，光谱的中红外区域显示了感染叶片发生剧烈变化，实验通过正常柑橘叶子与患病柑橘叶子在900～1 180 cm-1范围内产生峰值的碳水化合物，从而将感染植物与非感染植物区分开. 在这项实验中同时也使用来自已知疾病状态的179种植物的光谱开发了基于化学计量学的模型. 然后，这种模型预测被用于测量被测植物的状态，且结果准确性大于95%. 虽然感染了黄龙病的柑橘叶片具有鲜明的特征，可用于区分感染植物和健康植物，但其他许多柑橘类疾病也可显示出类似的可见症状，HAWKINS等[29]使用此光谱法将黄龙病与另外几种柑橘病(柑橘皱叶病毒，柑橘腐根病病毒，柑橘鳞皮病毒和柑橘溃疡病毒)和营养缺陷(铁、铜、锌、锰和镁)进行比较，以确定是否单独的光谱检测可用于鉴定感染黄龙病的植物. 结果表明，一些其他患有疾病和生理缺陷的植株的光谱与表观健康植物更为相似，而与患黄龙病的植株存在差异.

3 黄龙病的治疗方法

3.1 基于分子生物学的治疗方法

RAWAT等[30]利用META分析法、基因共表达和miRNA嵌套网络分析了柑橘在抵抗黄龙病病菌中的候选探针组，他们使用META分析中的LIMMA和RANKPROD[30]方法研究了22份可用于柑橘与黄龙病相互作用的转录组研究，其中包括18个易感(S)数据集和4个抗性(R)数据集. 之后又使用Teradata内部结构化查询语言(Structured Query Language，SQL)脚本生成了7 412个差异表达探针集的组合列表. 这项实验确定了来自S和R数据集的不同组织中HLB疾病调控的65种最常见的探针组. 这些探针组的基因本体分析表明，碳水化合物代谢，营养转运和生物胁迫是柑橘中被韧皮部杆菌亚洲菌种感染和黄龙病发展所调节的核心途径. 同时他们还鉴定了R特异性探针组，其编码富含亮氨酸的重复蛋白、几丁质酶、组成型疾病抗性、Miraculins和凝集素. 他们又对3 499个探针组进行加权基因共表达网络分析，并确定了21个具有主要探针组的模块. 此外，还创建了一个miRNA嵌套网络来检查3 499个目标探针组的基因调控. 最终结果表明：大多数潜在的候选中枢探针组与赤霉素途径(Gibberellin Pathway，GA Pathway)相关的探针组共表达，这意味着GA信号在HLB抗性中具有潜在作用. 该研究结果有助于理解现有的柑橘HLB转录组数据，有助于阐明柑橘与HLB相互作用的内在机制. 该分析鉴定出的柑橘探针可进一步用于验证HLB响应基因.

WANG等[31]用RNA-Seq评估2个不同柑橘品种(HLB耐受性“Jackson”葡萄柚样杂种树和HLB易感的“Marsh”葡萄柚树)感染HLB后的转录组差异. 结果表明：共有686个基因在2个品种间差异表达. 在HLB耐受柑橘中，247个基因被上调，439个下调. 在HLB耐受性和敏感型柑橘中，总共有619个基因的可变剪接出现显著差异. 进一步分析揭示了HLB耐受柑橘树中多种信号途径被抑制或活化，导致柑橘基础抗性或免疫力的激活. 最后利用实时荧光定量PCR实验也验证了耐受HLB的“Jackson”品种和HLB敏感的“Marsh”品种中14个上调基因和19个下调基因，结果表明：大多数基因的表达与RNA-Seq结果一致. 该研究为HLB耐受性的研究提供了新的思路，并为HLB耐受性柑橘的育种提供了有益的线索.

RAWAT[30]和WANG[31]的实验在分子生物学水平上对黄龙病提出了新的思路，而下面的这几位科学家则近期在转基因方面为柑橘黄龙病的治疗带来了新的方法.

柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)可以引起柑橘衰退病[32]. HAJERI等[33]开发了一种通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)缓解HLB的新方法. 首先利用CTV-RNAi表达了靶向柑橘八氢番茄红素去饱和酶基因的序列，结果表明其可导致其光漂白表型，这证明了CTV是一种基因沉默载体. 进一步将CTV-RNAi载体工程化为具有断裂的翼瓣异常(Abnormal wing disc，Awd)基因的载体，结果导致了木虱若虫中的Awd基因表达减少，造成成年木虱翼型畸形和死亡率增加，减少了介体传毒.

DUTT 等[34]为了研究对黄龙病的持续的抗病性，获得了在组成型CaMV35S启动子或在韧皮部特异性拟南芥SUC2(AtSUC2)启动子的控制下表达的拟南芥NPR1基因的转基因甜橙品种“Hamlin”和“Valencia”. 实验结果表明：拟南芥的NPR1(ArabidopsisthalianaNPR1，AtNPR1)的过表达导致实验柑橘对HLB的抗性有所增强. 最近杜克大学董欣年教授团队研究结果为水稻安上了一种“免疫系统开关”，这大大增强植物本身的免疫系统，并同时对抗多种病原体[35-36]. 那么这种免疫开关是否可能应用到黄龙病中，值得期待. 笔者课题组在与董欣年教授合作研究“自噬相关基因与NPRs之间关系”的基础上尝试将这一免疫开关应用到黄龙病的防治中去.

HAO等[37]尝试通过改良植物硫素的过表达来提高柑橘对HLB和柑橘溃疡的抗性. 首先修改并合成了编码植物硫素的序列，并克隆到二元载体pBinPlus/ARS中. 然后将构建体导入农杆菌菌株EHA105进行柑橘转化,得到了表达修饰的植物硫素的转基因植物；与非转基因植物相比，溃疡症状和细菌的生长量明显减少了. 此外，接种实验表明：柑橘对黄龙病的抗性明显增加. ZOU等[38]证明在韧皮部中特异表达杀真菌素B基因的转基因柑橘对黄龙病的敏感性降低. 该实验设计了3个植物密码子优化的合成天蚕素B基因，将天蚕素B肽设计到分泌至3个特定位点：细胞外空间、细胞质和内质网. 在韧皮部特异性启动子GRP1.8的控制下，将这些构建体转移到柑橘基因组中. 并在转基因植物的韧皮部中表达. 一年多的评估表明，转基因品系中黄龙病的症状和病原菌数量明显低于对照组.

综上所述，分子生物学技术特别是转基因技术为黄龙病的治疗方法带来了新的希望.

3.2 基于药物的治疗方法

YANG等[39]开发了一种透性纳米乳液制剂，可通过叶面喷雾把有效的抗生素通过柑橘角质层渗透到韧皮部中. 结果表明，使用酶法(果胶酶和纤维素酶)的角质层分离效率取决于柑橘栽培品种和Las-感染程度. 在所测试的8种佐剂中，Brij35使受HLB影响的角质层的通透性增加最大，与水分控制相比，角质层通透性提高了3.33倍. 使用偶联抗生素的纳米乳液制剂比对照更有效地降低了受柑橘中的黄龙病菌含量. 其研究表明：水包油(W/O)纳米乳液制剂可用以田间控制柑橘HLB.

CROXTON等[40]测试了金属化聚乙烯覆盖物对成年ACP(Asian citrus psyllid)的控制作用以及对HLB和早期树木生长的影响. 结果表明：与白面覆盖物或裸露表面相比，金属化覆盖物显着降低ACP种群和HLB发生率.

YANG等[41]将“热”处理(45 ℃或40 ℃)和磺酰胺处理(磺胺噻唑钠-STZ或磺胺二甲氧嘧啶钠-SDX)的组合应用于受HLB侵染的柑橘. 热疗和/或化疗后对HLB染病柑橘的细菌微生物群的PhyloChipTMG3元代谢特征分析表明：45 ℃热疗与STZ和SDX联合治疗对HLB的疗效比使用单一治疗方法更为有效.

本实验室将利用教育部重点实验室纳米材料制作方面的强项技术，开展纳米颗粒包埋药物进入植物体内后有序释放药物治疗黄龙病的研究.

3.3 其他方式

MARTINELLI等[42]测试了3种小分子化合物对黄龙病染病柑橘的修复能力，包括：(1)L-精氨酸；(2)6-苄基腺嘌呤与赤霉素组合物；(3)蔗糖与莠去津组合物. 实验分析了处理和未处理的成熟叶中糖和淀粉代谢相关的42个关键基因、激素相关途径、生物胁迫反应和次生代谢相关基因的表达. 结果表明：TGA5被精氨酸显著诱导；苄基腺嘌呤和赤霉素增强了生物应激反应相关的2个重要基因：WRKY54和WRKY59；蔗糖与莠去津组合上调了碳水化合物代谢的关键基因，如蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶和α-淀粉酶；莠去津还影响涉及系统性获得性抗性(SAR)的一些关键基因的表达，如EDS1、TGA6、WRKY33和MYC2. 数据表明：这些调节分子对黄龙病病树的治疗有一定作用. 本课题组拟在黄龙病防治研究过程中进行SAR关键基因表达的实验，期待筛选到标志性的黄龙病靶基因，为黄龙病防治做出积极有益的贡献.

4 展望

随着分子生物学技术的不断发展，越来越多难以解决的疾病都得到了治疗. 科学家们利用meta分析、基因共表达、miRNA嵌套网络[30]和RNA-seq[31]评估比较了不同柑橘物种间基因表达差异，证明了GA信号通路在黄龙病的抗性方面存在一定的作用. HAJERI[33]、DUTT[34]、HAO[37]、ZOU[38]等则在木虱和柑橘体内进行转基因研究表明：抗虫的转基因植物可控制传播虫媒，减少黄龙病蔓延；而抗病的转基因植物对致病病原菌增殖也有一定的效果，但周期也相对较长，还需进一步完善. 也有人从药物方面入手治疗黄龙病，CROXTON等[40]利用金属化聚乙烯附着在亚洲木虱上，隔绝了黄龙病病菌的传播；MARTINELLI等[42]则测试了L-精氨酸，6-苄基腺嘌呤与赤霉素组合，蔗糖与莠去津组合等小分子物质对黄龙病的影响. YANG等[41]则利用磺胺类抗生素药物治疗结合热治疗，可显著抑制黄龙病病菌的增殖. YANG等[39]还开发了一种透性纳米乳制剂，能够让抗微生物药物有效渗透到柑橘韧皮部中. 综上所述，转基因疗法和药剂治疗是现在比较热门的治疗黄龙病的方法.

笔者实验室在自噬相关基因和植物抗病之间的关系领域已经进行了多年的研究，取得了一定的成绩. 从2009年开始，笔者在研究植物细胞死亡的过程中陆续将焦点对准了自噬相关基因在植物超敏反应初期中的功能. 笔者课题组发现叶绿体的降解是依赖自噬途径的，但自噬途径并不是叶绿体降解的唯一途径，自噬介导的叶绿体降解能够促进增强RPS4介导的防御反应[43]；RBOHD在介导依赖NADPH途径的细胞自噬、ROS的产生和控制细胞死亡抵抗病原菌反应中起到重要作用[44]；ATG5对于限制P.Syringae所诱导的超敏反应程序性死亡是必需的，可能是通过SA信号途径引起的自噬作用[45]；NPR1(Nonexpressor of PR Gene)是一种锚蛋白，调控植物系统性获得抗病性，NPR1基因可调控植物广谱抗性的发生,在植物系统抗性中起着关键作用. 植物NPR1基因已成为植物抗病信号传导途径,以及植物抗病基因工程领域的研究热点. 目前本课题组进行了自噬相关基因与NPR1、NPR3和NPR4之间相互作用的关系研究，发现ATG7、NPR3和NPR4是植物防疫机制和衰老的负调控者，而NPR1却具有相反的功能. NPR3和NPR4通过影响自噬的2条类泛素化途来径调控自噬泡的形成和自噬小体在液泡中的降解[46]；EDS1通过调节“自噬流”的变化来影响自噬小体的活动，本课题组结果发现EDS1通过影响ATG5-ATG12连接途径来调节自噬[47]. 这些基础研究结果应该能很好地应用于农业生产进行应用性研究，服务于广东农业生产的发展. 本课题组初步打算先在广东的黄龙病的转基因抗病性研究方面做一些有意义的尝试. 笔者已经从美国佛罗里达大学wen-yuan SONG教授那里拿到了甜橙的NtNPR1质粒，打算用拟南芥NPR1及甜橙的NPR1基因，以及自噬相关基因进行转基因植物对于黄龙病的抗病研究.

而近期发展较为成熟的植物纳米转基因技术具有：转化效率高、实验周期短、受体材料限制少，便于推广等优势[48]，本实验室希望利用相关技术手段，对比农杆菌转基因柑橘，构建携带自噬相关基因或者NPR同源基因质粒的纳米颗粒，同时将药物包埋于纳米颗粒里面，期望高效治疗黄龙病，以期推动黄龙病转基因加药物相结合的治疗方法的进一步发展.

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Research Advances in the Detection and Treatment of Huanglongbing (Citrus Greening Disease)

CHEN Wenli1*, XU Wan1, CHENG Baoping2, PENG Aitian2, JIAO Yue1

(1. MOE Key Laboratory of Laser Life Science and Institute of Laser Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University,Guangzhou 510631, China; 2. Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640，China)

Huanglongbing (citrus greening disease) is a devastating disease in the citrus production. In recent years, the disease has occurred in many major producing areas of citrus in the world, which has aroused the concern of world researchers and citrus producers. Now, the pathogen thought to be a kind of phloem bacteria which is difficult to culture. Although there have been a variety of treatment methods against Huanglongbing, those methods only can alleviate the symptoms of the disease, we still lack effective treatments to cure it. In this article, we outlined the transmission, the detection and treatment methods of Huanglongbing, hoping to promote the study on combined treatments of nano material and drug for this disease.

2017-05-20 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(31570256；31170250)；广东省自然科学基金项目(2014A030313420)

*通讯作者:陈文利，教授，Email:chenwl@scnu.edu.cn.

S436

A

1000-5463(2017)05-0009-07

【中文责编：成文 编辑助理：冷佳奕 英文审校：李海航】