黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究①

安宏元 向川南 喻小兰 唐小平 张宇骄 夏纪毅⑤

(四川省泸州市人民医院乳腺外科，泸州646000)

·中医中药与免疫·

黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究①

安宏元 向川南 喻小兰②唐小平③张宇骄④夏纪毅③⑤

(四川省泸州市人民医院乳腺外科，泸州646000)

目的：探讨黄芩素和U0126体外对乳腺癌的作用及其机制。方法：用黄芩素、U0126单独处理以及二者联合处理人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，采用CCK8检测细胞增殖变化；流式细胞术检测MCF-7细胞周期以及凋亡变化；显微镜观察细胞数量变化； TUNEL法检测细胞凋亡改变；划痕实验分析细胞迁移情况； Western blot实验检测细胞凋亡相关因子的蛋白水平变化，分析黄芩素与U0126对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果：黄芩素或U0126可抑制细胞的增殖且具有浓度依赖性(P<0.05)；黄芩素阻滞MCF-7细胞周期进入S期，增加G0～G1期细胞比例(P<0.05)，降低S期细胞比例(P<0.05)，诱导细胞凋亡(P<0.05)；降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD1的蛋白水平表达；黄芩素与U0126联合处理MCF-7细胞，与黄芩素单独处理组相比较，S期细胞比例明显降低(P<0.05)，细胞凋亡更加明显(P<0.05)， ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P<0.05)、CyclinD1的蛋白表达量降低更加明显(P<0.05)；同时黄芩素可有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移(P<0.05)。结论：黄芩素和U0126通过降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表达，降低CyclinD1的水平表达，有效抑制MCF-7细胞增殖和迁移，诱导MCF-7细胞凋亡并且二者具有协同作用。因此，黄芩素和U0126联合有望用于临床治疗乳腺癌。

黄芩素；U0126；人乳腺癌细胞株MCF-7；凋亡；迁移

乳腺癌是当前社会的重大公共卫生问题，严重威胁着女性身心健康[1]。乳腺癌的增殖、凋亡和转移受多种信号通路的调控，如CyclinD1、ERK1/2和JNK等[2]。ERK1/2和JNK是有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员，二者可被多种蛋白激酶磷酸化并活化，然后进入细胞核，缩短G1期，促进细胞提前进入S期，介导细胞增殖失控、凋亡和恶性转移[3]。

黄芩素是黄芩中具有活性的黄酮类化合物，具有抗菌消炎和抗感染的功效。目前，已有研究报道，黄芩素抑制部分癌症细胞的转移，如宫颈癌、肺癌和前列腺癌等[4-6]，具有良好的临床应用前景，但其在乳腺癌中的作用效果还知之甚少[7]。U0126是ERK1/2的特异性抑制剂[8]，可抑制与癌症细胞增殖和转移相关的信号通路活性，与黄芩素等中药联合使用具有协同效应，有望在临床上得到广泛应用[9]。

乳腺癌细胞增殖失控和恶性转移是其致死的重要原因之一，人乳腺癌细胞株MCF-7具有低侵袭、低转移能力，为体外研究中西药对乳腺癌转移的影响提供了很好的细胞模型[10]。抑制乳腺癌细胞恶性增殖和转移，促进癌细胞凋亡是治疗乳腺癌的重要策略之一，因此本研究主要探讨黄芩素和U0126对MCF-7增殖、凋亡和转移的影响以及相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7购于上海肯强仪器有限公司；RPMI1640(美国Gibco公司)胎牛血清购于杭州四季青公司；青霉素和链霉素购于北京索莱宝公司；胰酶购于华美公司；黄芩素购于普瑞法科技有限公司；抑制剂U0126购于碧云天生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购于ROCHE公司；小鼠抗人GAPDH内参、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 购于碧云天生物科技公司；CyclinD1、ERK1/2、JNK引物均由上海生工合成；兔抗人CyclinD1抗体、兔抗人ERK1/2抗体、兔抗人P-ERK1/2抗体、兔抗人JNK抗体及兔抗人P-JNK抗体均购于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7由上海肯强科技有限公司提供，采用RPMI1640(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)培养液培养。培养条件：37℃，5%CO2的培养箱。

1.2.2 CCK8检测细胞增殖 对数生长期细胞制备细胞悬液，将100 μl 含2×104ml-1的MCF-7细胞悬液接种至96孔板中，贴壁后，按照不同浓度加入0、1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L的黄芩素和按照使用说明书给出的适用范围分别加入0、2、5、10、20 μmol/L的U0126，同时设置空白对照以及DMSO对照组， 37℃培养4 h；加入10 μl CCK8,混匀，培养4 h，生成Formazan，测定450nm吸光度(OD值)。设定空白对照1：在不含细胞的培养基中加入CCK8，测定450nm的吸光度(OD值)，空白对照2：在不含细胞加入黄芩素或U0126的培养基中加入CCK8，测定450nm的吸光度，实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期以及细胞凋亡情况 将1 ml 1.25×105ml-1的MCF-7细胞接种至12孔板，贴壁后，用黄芩素、U0126及黄芩素联合U0126处理细胞24 h，收集细胞，室温PBS洗涤两次，加入1 ml 70%预冷乙醇固定，过夜，离心去除乙醇；PBS重悬，加入RNase至终浓度为100 mg/L， 37℃水浴30 min，加入PI染色液至终浓度为50 mg/L，4℃避光染色3 min，用488nm的激发波长检测细胞周期分布。用细胞周期拟合软件进行分析结果，记录亚二倍体峰，即凋亡细胞峰sub-G1期、G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例。检测早期凋亡和晚期凋亡按照相关的试剂盒步骤进行操作。结果采用CellQuest软件进行分析。实验重复3次。

1.2.4 细胞显微摄影检测细胞数量变化 分别加入0、1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L黄芩素处理MCF-7细胞24 h，低倍镜下观察黄芩素对MCF-7细胞的数量变化。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 MCF-7细胞经10 μmol/L黄芩素及10 μmol/L U0126处理24 h后，移除培养液，PBS漂洗2遍，4%PFA室温固定10 min，PBS漂洗2遍，3%过氧化氢浸泡10 min，抑制内源性过氧化氢酶，PBS漂洗2遍，蛋白酶室温孵育30 min，PBS洗2遍，加入50 μl TUNEL反应液，室温湿盒中孵育1 h，PBS洗3遍，加convert-POD，室温30 min后，PBS再漂洗3遍，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水后中性树胶封片，显微镜下摄片分析结果。

1.2.6 Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白水平 20 μmol/L黄芩素和10 μmol/L U0126处理MCF-7细胞后，用4℃预冷的PBS冲洗细胞2次，离心去上清，加入含5%蛋白酶抑制剂的裂解液(RIPA强)，置冰上裂解30 min，转移蛋白液至已标记的Eppendorf管中，超声破碎后，10 000 r/min离心后取上清液，沸水变性5 min后，降至室温，-20℃保存备用。取5 μl蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，转膜到0.2 μmol/L PVDF膜上，5%脱脂奶粉的1×TBST封闭1 h，去除封闭液,PBS漂洗2次，10 min/次。一抗(ERK1/2稀释比例为1∶1 000，P-ERK1/2稀释比例为1∶800，JNK稀释比例为1∶1 000，P-JNK稀释比例为1∶800,CyclinD1稀释比例为1∶700，GAPDH稀释比例为1∶2 000)4℃孵育过夜。1×TBST漂洗3次，10 min/次，HRP羊抗小鼠IgG及HRP羊抗兔IgG(二抗稀释比例均为1∶2 000)室温孵育1 h，1×TBST漂洗3次，10 min/次，BIO-RAD凝胶成像仪成像后，Quantity one软件进行平均光密度值(Mean optical dengsity,MOD)分析，计算相关因子蛋白水平表达，实验重复3次。

1.2.7 划痕实验检测MCF-7细胞迁移 将0.5 ml 5×105个/ml的MCF-7细胞接种于24孔板，培养24 h后，形成单层细胞。用10 μl移液枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS洗3遍，然后加入所需的黄芩素或U0126，每组处理平行3个样本。培养24 h后，显微镜下观察黄芩素或U0126对MCF-7细胞迁移的影响。

2 结果

2.1 黄芩素或U0126抑制人乳腺癌细胞株MCF-7

细胞增殖 MCF-7细胞经不同浓度的黄芩素、U0126处理24 h后，CCK8实验结果表明，黄芩素或U0126可显著抑制MCF-7细胞增殖且具有浓度依赖性(P<0.05)，见图1。

2.2 黄芩素或U0126阻滞人乳腺癌细胞株MCF-7细胞周期 与空白对照组和DMSO对照组相比，人乳腺癌细胞株MCF-7经20 μmol/L黄芩素处理24 h后，G0～G1期细胞比例明显增多(P<0.05，图2)，S期细胞比例明显下降(P<0.05，图2)，采用20 μmol/L黄芩素与10 μmol/L U0126联合处理MCF-7细胞24 h后，S期细胞比例明显降低(P<0.05，图2)。此研究结果表明，黄芩素可显著增加MCF-7细胞G1期细胞比例，降低S期细胞比例，U0126可显著降低S期细胞比例。

图1 黄芩素或U0126抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖Fig.1 Baicalein or U0126 inhibited human breast cancer cell line MCF-7Note: *.P<0.05 vs control.

图2 黄芩素或U0126阻滞人乳腺癌细胞株MCF-7细胞周期Fig.2 Effect of Baicalein or U0126 on cell cycle of MCF-7Note: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L；4.20 μmol/L-baicalein+10 μmol/L-U0126；*.P<0.05 vs 1.

2.3 黄芩素或U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡 为进一步探讨黄芩素和U0126联合抗乳腺癌的作用，我们镜下观察黄芩素/U0126对乳腺癌细胞凋亡的影响。与空白对照组和DMSO组相比，不同浓度黄芩素处理MCF-7细胞24 h后， MCF-7细胞数量明显减少，且随着使用黄芩素浓度越高，乳腺癌细胞的数量减少越明显(图3)。

2.4 TUNEL法检测黄芩素或U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡 与空白对照组和DMSO组相比，TUNEL实验结果表明人乳腺癌细胞株MCF-7经20 μmol/L黄芩素单独处理24 h后，细胞凋亡现象明显(P<0.05)，MCF-7经20 μmol/L黄芩素和10 μmol/L U0126联合处理后，细胞凋亡现象更明显(P<0.05)(图4)。

2.5 黄芩素或U0126对MCF-7早期凋亡和晚期凋亡的影响 为进一步确认黄芩素/U0126影响细胞凋亡的具体过程，我们利用流式细胞术检测 MCF-7细胞经20 μmol/L黄芩素单独处理24 h后，MCF-7细胞的早期凋亡和晚期凋亡情况，结果显示黄芩素处理MCF-7细胞组与空白组或者DMSO组相比，早期凋亡和晚期凋亡均显著增多(P<0.05)，MCF-7细胞经20 μmol/L黄芩素和10 μmol/L U0126联合处理后，与两者单独处理组相比，早期凋亡和晚期凋亡均显著增多(P<0.05)。此研究结果表明，黄芩素和U0126均可诱导人乳腺癌细胞株MCF-7早期凋亡和晚期凋亡，且二者具有协同效应(图5)。

2.6 划痕实验检测黄芩素对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞迁移的影响 与空白对照组和DMSO组相比，人乳腺癌细胞株MCF-7经20 μmol/L黄芩素处理0、1、3和6 h后，划痕实验表明，细胞迁移距离受到明显抑制(P<0.05)。此研究结果表明，黄芩素可显著抑制人乳腺癌细胞株MCF-7迁移能力(图6)。

图3 黄芩素诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞数量减少Fig.3 Effect of Baicalein on number of MCF-7 cells in human breast cancer cell lineNote: *.P<0.05 vs control.

图4 黄芩素或U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡Fig.4 Baicalein or U0126 induced MCF-7 apoptosis in human breast cancer cell lineNote: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L-24 h；4.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L；*.P<0.05 vs 1.

图5 黄芩素或U0126对MCF-7早期凋亡和晚期凋亡的影响Fig.5 Effect of baicalein or U0126 on early apoptosis and late apoptosis of MCF-7Note: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L-24 h；4.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L；*.P<0.05 vs 1.

图6 黄芩素对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞迁移的影响Fig.6 Effect of baicalein on migration of MCF-7 cells in human breast cancer cell lineNote: *.P<0.05 vs baicalein 0 μmol/L.

图7 黄芩素或U0126降低MCF-7凋亡抑制蛋白活性及表达水平Fig.7 Effect of baicalein or U0126 on inhibition of MCF-7 apoptosis and expression level in human breast cancer cell lineNote: 1.Control;2.Control+DMSO;3.Baicalein-20 μmol/L;4.U0126-10 μmol/L;5.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L;*.P<0.05 vs 1.

2.7 黄芩素/U0126体外抗乳腺癌的分子机制 为探讨黄芩素与U0126抑制MCF-7细胞增殖的分子机制，我们利用Western blot检测 ERK1/2、JNK蛋白的磷酸化情况，利用Real-time PCR和Western blot 检测周期、增殖相关的蛋白CyclinD1表达水平，结果显示，与对照组以及黄芩素/U0126单独处理MCF-7细胞组相比，黄芩素与U0126联合作用MCF-7细胞24 h可以明显降低ERK1/2、JNK蛋白的磷酸化水平以及CyclinD1的mRNA和蛋白水平(图7)。

3 讨论

乳腺癌在乳腺疾病中是常见的恶性肿瘤，致死率较高。乳腺癌的恶性增殖、凋亡以及迁移是多基因参与的、复杂的病理学过程，因此探究乳腺癌的增殖、凋亡和迁移的分子机制，寻找乳腺癌的新疗法具有重要意义。

黄芩素和U0126具有明显的抗癌作用，前期研究表明黄芩素作为一种中药，通过增加凋亡相关蛋白Bax表达，抑制CDC2激酶活性等多种途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡[11]。U0126通过特异性抑制ERK信号通路活性诱导细胞凋亡[8]。我们的研究表明黄芩素/U0126可以抑制乳腺癌细胞MCF-7细胞株的增殖并诱导细胞凋亡且具有浓度依赖性，二者联合使用组，相对于单独使用组，诱导乳腺癌细胞凋亡的作用更加显著。

已有研究报道，高转移倾向乳腺癌细胞和组织中，ERK1/2的表达水平和磷酸化水平增高[12]。ERK1/2的磷酸化激活是细胞周期进入S期的关键，它促进细胞由G1期向S期转化，从而促进细胞增殖[13]。CyclinD1是经典Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，可促进细胞进入S期，Halleskog等[14]报道ERK1/2可促进β-catenin进入细胞核，从而调控CyclinD1的表达，进而影响乳腺癌细胞生长和细胞周期改变。这与本研究实验结果一致：黄芩素/U0126可以降低ERK1/2和JNK的磷酸化水平，进一步调控其信号通路下游分子CyclinD1，降低其表达水平。CyclinD1作为周期相关蛋白，表达量降低阻滞细胞进入S期，从而导致S期细胞所占比例降低同时G1期细胞增多。

促进癌细胞凋亡是治疗癌症的策略之一。Bcl-2家族蛋白由抑制细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-x/L)和促进细胞凋亡蛋白(Bax、Bad等)组成，两者相互作用调控细胞凋亡[15]。已有研究报道，ERK激酶活化后可调节线粒体途径引起的凋亡[16]。本研究结果表明：不同浓度的黄芩素和U0126处理MCF-7细胞后，降低ERK1/2和JNK的磷酸化水平，促进癌细胞凋亡，包括早期凋亡和晚期凋亡。

癌症恶性转移是导致高致死率的重要原因，乳腺癌最常发生转移的部位有骨转移(肋骨、胸骨等)、肺及胸膜转移、肝转移和脑转移[17]。目前，已经研制了多种癌症抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素-α和其他化学药物[18]，但由于药物的局限性，寻找新型抗转移的药物是十分必要的。黄芩素联合小分子抑制剂U0126可以显著抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移作用，这为二者在临床使用提供重要的理论依据。

综上所述，黄芩素和U0126可通过调控ERK1/2和JNK信号通路，显著抑制人乳腺癌细胞株MCF-7增殖、凋亡和转移，因此二者有望用于乳腺癌临床治疗。

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[收稿2016-08-08]

(编辑 倪 鹏)

Anti-cancer by baicalein combined with U0126 on human breast cancer in vitro

ANHong-Yuan,XIANGChuan-Nan,YUXiao-Lan,TANGXiao-Ping,ZHANGYu-Jiao,XIAJi-Yi.

TheDepartmentofBreastSurgery,SichuanProvinceLuzhouPeople′sHospital，Luzhou646000，China

Objective:To investigate the effects and mechanisms of anti-cancer by bacailein combined with U0126 on human breast cancer in vitro.Methods: The human breast cancer cell line MCF-7 was treated by baicalein,U0126 and baicalein combined with U0126 respectively.CCK8 assay measured cell proliferation of MCF-7;flow cytometry tested the cell cycle and apoptosis of MCF-7;microscopy observed the amount;TUNEL assay evaluated the apoptosis of MCF-7;Western blot detected the protein level of proliferation and apoptosis related protein；scratch assay measured the ability of migration.Results: Human breast cancer cell line MCF-7 was treated by baicalein or U0126 at different concentration for 24 h,CCK8 assay suggested that both of them can dramatically inhibit MCF-7 proliferation in a dose-dependent way (P<0.05).Compared to the blank and DMSO groups,the human breast cancer cell line MCF-7 was treated with baicalein for 24 h,the cellular rate at G0-G1 phase increased a lot (91%) (P<0.05),while the cellular rate at S phase reduced dramatically (P<0.05),cell apoptosis increased dramatically by microscopy and TUNEL assay(P<0.05),the level of ERK1/2,CyclinD1 and JNK reduced quickly (P<0.05).Compared to the baicalein group,MCF-7 was treated by baicalein combined with U0126,the cellular rate at S phase decreased remarkably (P<0.05),apoptosis was much obvious (P<0.05),the phosphorylation level of ERK1/2 and JNK reduced a lot (P<0.05),and the proliferation accelerator CyclinD1 highly decreased (P<0.05);the scratch assay demonstrated that cell migration was dramatically inhibited when MCF-7 was treated by 20 μmol/L baicalein(P<0.05).Conclusion: Both of baicalein and U0126 can inhibit the proliferation and migration,induce the apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7 through decreasing the level of ERK,JNK and CyclinD1.Baicalein and U0126 can provide some novel avenues to treat breast cancer in clinic.

Baicalein;U0126;Human breast cancer cell line MCF-7;Apoptosis

安宏元(1985年-)，女，在读硕士，医师，主要从事乳腺癌的机制研究。

及指导教师：夏纪毅(1979年-)，男，硕士，高级实验师，主要从事肿瘤的分子机制研究，E-mail：xjyi0615@163.com。

R73

A

1000-484X(2017)02-0206-06

①本文为四川省科技厅项目(14JC01353-LH67)和四川省泸州市科技局项目(2014-S-44)。

②西南医科大学附属中医医院妇产科，泸州646000。

③西南医科大学附属医学实验中心，泸州646000。

④西南医科大学附属医院妇产科，泸州646000。

⑤西南医科大学信息与工程学院现代教育技术中心，泸州646000。