GeXP检测rhIL-24联合DDP对人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡相关基因的实验研究①

郭锦锦 王少慧 孙万邦 宋明英 唐艳丽

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海519041)

GeXP检测rhIL-24联合DDP对人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡相关基因的实验研究①

郭锦锦 王少慧②孙万邦 宋明英 唐艳丽③

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海519041)

目的：利用多基因遗传表达分析系统(GeXP)探讨重组人白细胞介素-24(rhIL-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞6个凋亡相关基因的变化。方法：用rhIL-24、DDP及rhIL-24+DDP干预A549/DDP细胞，应用多基因遗传表达分析系统(GeXP)同时检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、Rb与P53等6个凋亡相关基因。结果：rhIL-24蛋白可引起A549/DDP细胞Bax基因、Caspase3基因、Rb基因转录上调；Bcl-2基因、Survivin基因转录下调，但抑癌基因P53变化无规律，rhIL-24 联合DDP 后Bax、Survivin、Rb表达较单独rhIL-24组变化更加显著。结论：rhIL-24蛋白可通过上调Bax，下调Bcl-2、Survivin，激活Caspase3，上调抑癌基因Rb诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡。

多基因遗传表达分析系统；白细胞介素-24；肺腺癌；凋亡

原发性肺癌是危害我国城乡居民的恶性肿瘤之一，居我国癌症死因首位，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%。目前肺癌较难治愈，主要以手术，放化疗为主，但由于80%的肺癌患者发现时已为晚期，失去手术治疗的最佳时期，所以化疗在肺癌的治疗中起重要作用。临床上肺癌的化疗主要是以顺铂为一线化疗药物多药联合应用，但由于肺癌治疗中多药耐药的出现以及化疗药物严重的副作用，肺癌的治疗效果并不理想。IL-24作为一种新型的抑癌因子，为肺癌的治疗提供了新的思路。我们前期研究发现[1]人白细胞介素-24(human interleukin-24,hIL-24)可抑制人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞的生长，诱导A549/DDP细胞凋亡、调控细胞周期等发挥抗肿瘤生物学作用，联合顺铂(DDP)后生长抑制效果更加明显，为了探究IL-24对A549/DDP细胞的凋亡诱导机制，我们将rhIL-24蛋白、DDP、rhIL-24联合DDP作用于A549/DDP细胞，以Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb为目的基因，B2M、ACTB、ESD、YAP1、TBP为内参基因，利用多基因表达分析系统进行检测，对rhIL-24蛋白作用机制进行研究，以期为IL-24治疗肺癌的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP购于中南大学湘雅医学院中心实验室；rhIL-24蛋白购于美国R&D公司；RPMI1640培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于Hyclon公司；DDP购于山东齐鲁制药；多基因遗传表达分析系统购于美国贝克曼库尔特(Beckman)公司。

1.2 方法

1.2.1 A549/DDP细胞培养 A549/DDP细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、5%CO2培养。取对数生长期的细胞，接种于无菌培养瓶，分别加入rhIL-24(160 ng/ml)、DDP(3 μg/ml)、rhIL-24(160 ng/ml)+DDP(3 μg/ml)，培养24 h后收集细胞。

1.2.2 RNA 的提取 将阴性组、rhIL-24组、DDP+ rhIL-24组A549/DDP细胞铺于6孔板中，每孔加1 ml Trizol，晃动后吹打吸取，加入氯仿混匀，10 000 r/min 4℃离心15 min，吸取上层至离心管中，加入异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10 min。10 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。加入75%乙醇混匀， 8 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清。加入20 μl DEPC水溶解，-70℃冻存。

1.2.3 引物设计 引物由GeXP Express软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列及长度参考文献[2]。

1.2.4 RT引物验证 配置RT反应试剂，反应条件为48℃，1 min、42℃，60 min、95℃，5 min、4℃，Hold；置XP-PCR反应试剂，反应体系与反应条件参考文献[3]。

1.2.5 RT引物浓度优化 引物验证之后，根据峰图，将RT引物分为信号过强组与信号正常组，将信号过强组进行适当的稀释，信号正常组同前，引物配置完成后，将信号过强组再进行倍比稀释。根据调整过后RT引物配置RT反应试剂，反应条件如方法1.2.4；配置XP-PCR反应试剂，反应体系及反应条件如1.2.4。GeXP上样，运行样本。

1.2.6 RT引物浓度确认 引物浓度优化之后，根据调整过后RT引物配置RT反应试剂，反应条件如1.2.4；配置XP-PCR反应试剂，反应体系及反应条件参照文献[3]。GeXP上样，运行样本。确定最终引物浓度。

1.2.7 样品检测 处理样品，使其浓度为10 ng/ml，根据之前所确认的引物浓度配置RT与XP-PCR反应体系，上机检测。

2 结果

2.1 GeXP检测阴性组A549/DDP细胞凋亡相关基因表达水平变化 取对数生长期的A549/DDP细胞提取RNA，经GeXP检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因，结果见图1。

2.2 GeXP检测rhIL-24及联合组作用A549/DDP后凋亡相关基因表达水平变化 将rhIL-24干预对数生长期的A549/DDP细胞，提取RNA，经GeXP检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因，结果见图2。

2.3 GeXP检测联合组作用A549/DDP后凋亡相关基因表达水平变化 将rhIL-24联合DDP干预对数生长期的A549/DDP细胞，提取RNA，经GeXP检测Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因，结果见图3。

图1 阴性组凋亡相关基因变化峰图Fig.1 Apoptosis related gene changes of negative groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

图2 rhIL-24组凋亡相关基因变化峰图Fig.2 Apoptosis related gene changes of rhIL-24 groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

图3 联合组凋亡相关基因变化峰图Fig.3 Apoptosis related gene changes of joint groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M ;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

图4 各组凋亡相关基因的分析Fig.4 Analysis of apoptosis related genes in each groupNote: A.Bcl-2 gene;B.Bax gene;C.Caspase3 gene;D.Survivin gene;E.Rb gene;F.P53 gene；*.P<0.05 compared with negative group,#.P<0.05 compared with rhIL-24 group.

2.4 GeXP检测各组作用A549/DDP后凋亡相关基因表达水平变化 将rhIL-24干预A549/DDP细胞24 h后经GeXP检测，结果显示与阴性组相比引起rhIL-24组Bax基因转录上调，Bcl-2基因转录下调，Survivin基因转录下调，Caspase3基因转录上调，抑癌基因Rb基因转录上调，但引起抑癌基因P53基因转录下调。联合组作用A549/DDP细胞后与阴性组相比引起Bax基因转录上调，Bcl-2基因转录明显下调， Survivin基因转录下调，Caspase3基因转录上调，抑癌基因Rb基因转录上调，联合组抑癌基因P53与阴性组比较无明显变化。联合组作用A549/DDP细胞后与rhIL-24组相比Bax基因转录上调明显，Survivin基因转录下调明显，Rb基因转录上调明显。结果见图4。

3 讨论

肺癌是全世界癌症导致死亡的首位原因[4]，化疗在肺癌的治疗中占有重要的地位，顺铂作为肺癌化疗的一线药物由于其严重的副作用以及耐药性限制了其应用。IL-24属于IL-10家族成员[5]，作为一种新型的细胞因子，研究发现其对肝癌、结肠癌、食管癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤都有抑制作用[6-9]，而对正常细胞无毒副作用[10]。我们前期研究发现IL-24可以抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长，诱导其凋亡，联合DDP后抑制效果更加明显，为IL-24单独或者联合化疗应用于肺癌的治疗，从而减小化疗药物的用量，降低化疗药物所带来的副作用提供了实验基础。rhIL-24抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长，诱导其凋亡可能存在何种机制？为了解决这个问题，我们选取了在肺癌发生发展过程中相关的6个凋亡相关基因，经干预后利用多基因遗传表达分析系统分析凋亡相关基因的变化，探索IL-24的作用机制。

Bcl-2是多基因家族，包括抗凋亡基因如Bcl-2、BAD等，促凋亡基因如Bax、Bak等。它们与肿瘤的发生、发展及预后有着密切的关系， Bcl-2/Bax 的比值与肿瘤的发展密切相关[11]，比值越低凋亡抑制作用越明显。其促进细胞凋亡的机制为Bcl-2蛋白主要定位于线粒体外膜，它与促凋亡蛋白Bax相互拮抗，细胞受到凋亡诱导后，促凋亡蛋白由细胞质转向线粒体形成跨膜通道，细胞色素C 自线粒体释放至胞质，使Caspase 蛋白酶激活，从而导致细胞凋亡。研究显示利用姜黄素干预肺癌细胞后，Bcl-2基因转录下调，Bax基因转录上调[12]，这表明Bcl-2与Bax转录水平的变化与肺癌有关联。经GeXP系统检测发现，rhIL-24蛋白可引起A549细胞的Bax基因转录上调，Bcl-2基因转录下调，Bcl-2/Bax 的比值降低，Bcl-2/Bax比值rhIL-24组较阴性组降低，联合组用药后Bcl-2/Bax比值较阴性组降低，说明IL-24诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株的凋亡与 Bcl-2基因家族有关。

Survivin是凋亡抑制基因家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，Caspase3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，为参与细胞凋亡执行基因之一，是细胞凋亡的执行者，被激活的执行者Caspase3通过对Caspase靶蛋白的水解，促进细胞的凋亡。Survivin可直接作用Caspase，抑制Caspase3的活性，从而抑制肿瘤细胞凋亡，研究表明Survivin基因多态与肺癌的易感性有密切关系[13]。有研究显示Caspase3在肺癌的发生发展中重要作用[14]。本研究经多基因遗传表达分析系统检测后显示单独用rhIL-24组与联合组Caspase3基因转录上调，Survivin基因转录下调，Caspase3基因转录上调水平及Survivin的下调水平较阴性组有显著性差异， 此结果说明IL-24可以通过下调凋亡抑制基因Survivin，降低其对Caspase3活性的抑制，从而促进人肺腺癌耐顺铂细胞株的凋亡。

Rb (Retinoblastoma,Rb)基因即成视网膜细胞瘤基因，属于抑癌基因的一种。Rb基因定位于chr13q上，而chr13q染色体区抑癌基因的丢失或失活与肺癌的发生有密切关系，Rb基因对细胞生长控制能力的丧失可能在肺癌的发生发展中起重要作用，Liu等[15]用腺病毒介导的Rb基因治疗小鼠非小细胞肺癌移植模型，肿瘤得到了改善。经多基因遗传表达分析系统检测后显示单独用rhIL-24组与联合组抑癌基因Rb基因转录上调，其上调水平较阴性组有显著性差异，且Rb基因转录上调水平联合组与单独用rhIL-24组比较存在显著性差异。IL-24可以通过上调抑癌基因Rb表达水平，增强Rb基因对细胞的生长控制能力，从而抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株的生长。且联合DDP后，Rb表达水平更高。

野生型P53为肿瘤抑制基因，其抑制肿瘤的生长，p53基因的失活对肿瘤的形成起重要作用。Kawabe等[16]将表达p53基因与不表达P53基因的两种肺癌细胞进行Ad-IL-24联合放疗干预，结果显示IL-24都可以增强两种细胞株的放疗敏感性[16]。另有研究将不同肝癌细胞系转入IL-24基因，经检测发现IL-24抑制肝细胞的生长，诱导凋亡并不依赖于P53基因的状态，本实验中抑癌基因P53转录无规律与上述结果一致[17]。

综上所述，rhIL-24可抑制人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP细胞的生长，诱导A549/DDP细胞凋亡，其凋亡相关基因的转录水平变化是其凋亡抑制效应的重要机制之一，rhIL-24联合DDP后效应更加明显，为肺癌的新型生物治疗策略提供了理论和实验依据。

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[收稿2016-07-07 修回2016-09-23]

(编辑 倪 鹏)

Effect of rhIL-24 combined with DDP on expression of apoptosis-related genes in human lung adenocarcinoma A549/DDP cells using GeXP

GUOJin-Jin,WANGShao-Hui,SUNWan-Bang,SONGMing-Ying,TANGYan-Li.

ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege&ImmunologicalGraduateEducationInnovationBastofGuizhouProvince,Zhuhai519041,China

Objective:To investigate the change of apoptosis-associated genes in human lung adenocarcinoma cell lines A549/DDP cells，which were induced by the recombinant human interleukin-24(rhIL-24) combined with Cisplatin (DDP).Methods: Six genes expression level by GeXP genetic analysis system at the same time,after rhIL-24,DDP and rhIL-24+DDP were used to intervene in A549/DDP cells.Results: rhIL-24 could induce Bax gene,Caspase3 gene and Rb gene transcription up regulation;Bcl-2 gene and survivin gene transcription down regulation.But no regular change in the genes expression level of P53.Bax,Survivin and Rb were more obviously changed after rhIL-24 combined with DDP.Conclusion: RhIL-24 can induce apoptosis of A549/DDP cells through upregulated the genes expression level of Bax,Caspase3,Rb and down regulated of Bcl-2，Survivin.

GeXP analysis system;Interleukin-24;Lung adenocarcinoma cell;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.005

郭锦锦(1986年-)，女，硕士，实验师，主要从事肿瘤免疫研究， E-mail:guojin1986719@163.com。

及指导教师：孙万邦(1950年-)，男，教授，主要从事分子免疫学研究，E-mail:sunwb7224@sina.com。

R392.5 R392.11

A

1000-484X(2017)02-0186-04

①本文为遵义医学院硕士启动资金项目(F-719)。

②广州白云区人民医院，广州510545。

③深圳龙岗区妇幼保健院，深圳518172。