胸苷激酶 1 与 Ki67 在骨肉瘤中的表达及其临床意义

傅宇成 郑传禧 张世权 关弘 李伟 谭纪锋

. 临床研究与实践 Clinical research and practice .

胸苷激酶 1 与 Ki67 在骨肉瘤中的表达及其临床意义

傅宇成 郑传禧 张世权 关弘 李伟 谭纪锋

目的 检测骨肉瘤组织中胸苷激酶 1 ( thymidine kinase 1，TK1 ) 及 Ki67 的表达水平，并分析 TK1 与 Ki67 之间的表达差异及其与患者临床预后的关系。方法 应用免疫组织化学 MaxVisionTM法测定TK1 及 Ki67 在 50 例骨肉瘤和 20 例骨软骨瘤中表达情况。结果 TK1，Ki67 在骨肉瘤组中阳性率分别为 84% ( 42 / 50 )，54% ( 27 / 50 )，在骨软骨瘤对照组中阳性率分别为 10% ( 2 / 20 )，15% ( 3 / 20 )，两组间 TK1，Ki67表达差异有统计学意义。在骨肉瘤组中 TK1 阳性率高于 Ki67 并具有统计学意义。TK1 及 Ki67 的表达均与患者 Enneking 分期、局部复发相关，而与性别、年龄、肿瘤大小、病理类型等均无关。同时 TK1 的表达与患者肺转移及化疗后肿瘤坏死率相关。TK1 高表达 ( 阳性率＞25% ) 患者中位生存时间短于低表达者。单因素分析表明，局部复发、Enneking 分期、肺转移及 TK1 表达水平是影响骨肉瘤患者预后的因素。多因素分析显示，肺转移 ( P＝0.012 ) 及 TK1 表达水平 ( P＝0.002 ) 是影响骨肉瘤预后的相关独立因素。结论 TK1，Ki67 在骨良、恶性肿瘤中的表达显著，差异有统计学意义，且 TK1 在骨肉瘤中敏感性强于 Ki67；TK1 与骨肉瘤临床病理学特征的联系较 Ki67 紧密；TK1 的表达可作为预测骨肉瘤预后的指标，而 Ki67 则无此特性。

骨肉瘤；免疫组织化学；胸苷激酶；Ki-67；预后

胸苷激酶 ( thymidine kinase，TK ) 是胸腺嘧啶核苷合成 DNA 的关键酶之一[1]，它以 TK1 及 TK2两种同工酶的形式出现。TK2 位于细胞线粒体中，其表达与细胞周期无关。TK1 是一种细胞周期相关酶，定位于细胞质及细胞核，它的表达与 DNA 的合成呈正相关[2]。TK1 能够调控细胞内胸苷含量，并参与 DNA 的修复过程[3]。在正常的增殖细胞及肿瘤细胞中，TK1 浓度于 S 期 ( DNA 合成期 ) 早期开始升高，并持续增长至 G2 期 ( DNA 合成后期 )。有研究显示，TK1 与肺癌、直肠癌、乳腺癌及宫颈癌患者的复发、3～5 年生存率及手术疗效相关[4-5]，因此，TK1 表达浓度升高往往提示恶性肿瘤细胞的增殖活性较高，预示着患者的预后较差[6-8]，但其在骨肉瘤中的研究却鲜见报道。

Ki67 是一种细胞增殖相关的核蛋白，其功能与细胞有丝分裂密切相关，在除 G0 期外的细胞周期中表达。Ki67 被广泛应用于测定各种肿瘤增殖活性[9]，同时，研究发现 Ki67 可能是判断肿瘤良、恶性，组织学分级和预后的一个较好指标，而与 Ki67表达相关的特异性基因有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点[10-11]。

本研究通过选取临床工作中骨肉瘤患者的送检标本，应用免疫组织化学 MaxVisionTM法对其进行检测，旨在探讨 TK1 与 Ki67 之间的表达差异及其与患者临床预后的关系。

材料与方法

一、纳入与排除标准

( 一 ) 骨肉瘤组

1. 纳入标准：( 1 ) 选自 2008 年 1 月至 2012 年2 月于我院就诊骨肉瘤患者；( 2 ) 经临床、影像、病理三者结合诊断为原发性骨肉瘤患者；( 3 ) 经病理确诊后均行术前化疗－手术－术后化疗的规范化综合治疗；( 4 ) 留有化疗前肿瘤组织标本的患者。

2. 排除标准：( 1 ) 合并其它类型骨肿瘤者；( 2 ) 合并其它组织器官良、恶性肿瘤者；( 3 ) 就诊前已于外院化疗或手术者。

共纳入 50 例。男 25 例，女 25 例，男女之比为 1∶1。患者年龄 8～41 岁，平均年龄 ( 23.60± 12.05 ) 岁。肿瘤部位：股骨 20 例，胫腓骨 18 例，肱骨 8 例，其他部位 4 例。按照 Enneking 分期：I 期 6 例，II 期 37 例，III 期 7 例。组织病理学分型：普通型骨肉瘤 42 例 ( 骨母细胞性骨肉瘤 25 例，软骨母细胞性骨肉瘤 8 例，纤维母细胞性骨肉瘤 9 例 )，非普通型骨肉瘤 8 例 ( 骨旁骨肉瘤 3 例，髓内高分化骨肉瘤 5 例 )。

( 二 ) 骨软骨瘤组

1. 纳入标准：( 1 ) 选自 2008 年 1 月至 2012 年2 月诊断为骨软骨瘤患者；( 2 ) 均为四肢单发病变；( 3 ) 病变均经病理诊断确诊为骨软骨瘤者。

2. 排除标准：( 1 ) 合并其它类型骨肿瘤患者；( 2 ) 合并其它组织器官良、恶性肿瘤者。

共纳入 20 例。男 9 例，女 11 例，平均年龄( 11.27±4.28 ) 岁。全部患者均采用电话或定期门诊随访，随访时间从病理确诊日开始至死亡 ( 或最后一次随访 )，随访截止日期为 2015 年 3 月 15 日。

二、实验主要试剂

TK1 试剂盒购自深圳华瑞同康生物技术有限公司，Ki67 单克隆抗体、快捷型聚合物标羊抗鼠 / 兔IgG、DAB 显色剂、柠檬酸抗原修复液 ( pH6.0 ) 均购自福州迈新生物技术有限公司。

三、免疫组化方法

标本为经 10% 甲醛固定石蜡包埋的组织块，切片厚度为 4 μm，连续切片，应用免疫组织化学MaxVisionTM法检测 TK1 与 Ki67 的表达，操作步骤严格按说明书进行。滴加一抗前均经抗原修复( 95 ℃ 持续 20 min )，DAB 显色后苏木精对照染色。PBS 代替一抗做阴性对照。

四、实验结果判断

每张切片随机选取 10 个高倍视野，以阳性细胞计数占同类细胞的百分比作为计数点，选取其平均值为该患者的细胞阳性率，并据此对染色结果进行判定：( - ) 瘤细胞染色阴性或＜5% 的瘤细胞有少量着色，( + ) 5%～25% 瘤细胞呈阳性，( ++ ) 26%～50% 瘤细胞阳性，( +++ )＞50% 瘤细胞阳性且着色程度较强。所有染色标本均由 2 位经验丰富的病理医师在双盲分析下分别计数，相同判定结果直接纳入统计，有差异的结果经另一病理医师双盲判定后取 3 位判定的平均值纳入统计。

五、统计学处理

实验数据应用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析。两组阳性率之间比较采用卡方检验；生存分析采用Kaplan-Meier 法和 Log-rank 非参数检验；Cox 比例风险模型进行多因素生存分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、TK1、Ki67 在骨肉瘤与骨软骨瘤组织中的表达

TK1 阳性表达为细胞核及细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒 ( 图1，2 )。50 例骨肉瘤标本中，阳性率为 84% ( 42 / 50 )，其中 ( - ) 8 例，( + ) 17 例，( ++ ) 19 例，( +++ ) 6 例，而对照组 20 例骨软骨瘤标本中，阳性率为 10% ( 2 / 20 )，其中 ( - ) 18 例，( + ) 2 例，( ++ ) 0 例，( +++ ) 0 例。Ki67 阳性表达为细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒 ( 图3，4 )。50 例骨肉瘤组中阳性率为 54% ( 27 / 50 )，其中 ( - ) 23 例，( + ) 20 例，( ++ ) 4 例，( +++ ) 3 例。对照组20 例骨软骨瘤标本中，阳性率为 15% ( 3 / 20 )，其中 ( - ) 17 例，( + ) 3 例，( ++ ) 0 例，( +++ ) 0 例。结果显示：( 1 ) TK1 与 Ki67 在良、恶性骨肿瘤对照组间的阳性率差异均有统计学意义 ( P＜0.01，表1 )；( 2 ) 骨肉瘤组中 TK1 与 Ki67 间的阳性率差异有统计学意义 ( P＜0.01，表2 )。

图1 TK1 在骨肉瘤细胞质和细胞核中表达 ( 免疫组化 MaxVisionTM法，DAB，× 400 )图2 TK1 在骨软骨瘤细胞质和细胞核中表达( 免疫组化 MaxVisionTM法，DAB，× 400 )图3 Ki67 在骨肉瘤细胞核中表达 ( 免疫组化MaxVisionTM法，DAB，× 200 )图4 Ki67 在骨肉瘤细胞核中表达 ( 免疫组化MaxVisionTM法，DAB，× 400 )Fig.1 The immunohistochemistry showed expression of TK1 in nucleus and cytoplasm of osteosarcoma ( by immunohistochemical MaxVisionTM, by DAB, × 400 )Fig.2 The immunohistochemistry showed expression of TK1 in nucleus and cytoplasm of osteochondroma ( by immunohistochemical MaxVisionTM, by DAB, × 400 )Fig.3 The immunohistochemicsl staining showed expression of Ki67 in nucleus of osteosarcoma ( by immunohistochemical MaxVisionTM, by DAB, × 200 )Fig.4 The immunohistochemistry showed expression of Ki67 in nucleus of osteosarcoma ( by immunohistochemical MaxVisionTM, by DAB, × 400 )

表1 TK1、Ki67 分别在骨肉瘤与骨软骨瘤中的表达比较Tab.1 Comparison of the expressions of TK1 and Ki67 in osteosarcoma and osteochondroma

表2 骨肉瘤组中 TK1 与 Ki67 的表达比较Tab.2 Comparison of the expressions of TK1 in osteosarcoma

二、TK1、Ki67 表达与临床病理因素的关系

TK1 及 Ki67 的表达 水平与患者性别、年龄、肿瘤大小及组织病理学类型无关，而与 Enneking 分期及局部复发密切相关，Enneking III 期及局部复发的骨肉瘤患者其 TK1 及 Ki67 的表达水平明显高于 Enneking I＋II 期及局部未复发患者，差异有统计学意义 ( TK1：P1＝0.03，P2＝0.008，Ki67：P1＝0.038，P2＝0.015 )。

本实验将术前化疗后切片显示肿瘤坏死率≥90% 视为化疗有效，共计 30 例，其 TK1 水平明显低于化疗效果欠佳组 ( 肿瘤坏死率＜90% )，差异有统计学意义 ( P＝0.028 )，而 Ki67 表达水平差异无统计学意义 ( P＞0.05 )。本实验共计 22 例发生肺部转移，其 TK1 表达水平高于无肺部转移组患者，差异有统计学意义 ( P＝0.026 )，而 Ki67 表达差异无统计学意义 ( P＞0.05，表3 )。

三、TK1、Ki67 的表达与骨肉瘤患者生存预后的关系

50 例骨肉瘤患者，术后死亡 16 例，总计 3 年生存率为 68% ( 34 / 50 )。将所有患者按切片染色阳性率分为两组，阳性率＞25% 为高表达组，≤25%为低表达组。TK1 高表达与低表达两组患者的中位生存时间分别为 22 ( 95% CI：13～34 ) 个月和 35 ( 95% CI：25～49 ) 个月，TK1 低表达组患者的中位生存时间显著延长 13 个月，差异有统计学意义( χ2＝15.3，P＜0.05 )。Ki67 的表达强度与患者的中位生存时间差异无统计学意义 ( P＞0.05 )。

表3 骨肉瘤组织中 TK1 及 Ki67 表达与临床病理参数之间的关系Tab.3 Expression of TK1 and Ki-67 in relation to clinicopathological features in osteosarcoma

运用单因素生存分析处理各临床、病理参数与患者预后间的关系，结果表明性别、年龄、组织学分型、肿瘤坏死率、肿瘤大小、Ki67 表达强度等与骨肉瘤患者预后无关；TK1 表达强度、Enneking 分期、局部复发、肺转移是影响骨肉瘤患者预后的相关因素。Cox 回归多因素分析显示，TK1 的表达水平 ( P＝0.002 ) 及肺转移 ( P＝0.012 ) 是影响骨肉瘤患者预后的独立因素 ( 表4 )。

表4 Cox 多因素模型回归分析影响骨肉瘤患者预后的因素Tab.4 Cox regression analysis of prognostic factors in osteosarcoma

讨 论

TK1 是近年新发现的与细胞增殖紧密相关的关键酶之一，其定位于细胞质及细胞核，表达水平与DNA 的合成呈正相关。TK1 能够调控细胞内胸苷含量，并参与 DNA 的修复过程[4]。有研究显示，TK1和许多恶性肿瘤患者预后紧密相关[12-14]。Ki67 蛋白是在增殖细胞中发现的一种核蛋白，它在除 G0 期以外的所有细胞周期中均有表达。作为敏感的核蛋白抗 原，Ki67 能反映增殖细胞活性，被广泛应用于恶性肿瘤组织的诊断。一些研究显示 Ki67 的表达与骨肉瘤的恶性程度及预后等因素密切相关[15]。

本实验通过免疫组化方法检测 50 例原发骨肉瘤患者中 TK1 及 Ki67 的表达率，同时选取 20 例临床中常见的良性骨肿瘤——骨软骨瘤行对照研究。结果显示骨肉瘤组中 TK1 及 Ki67 阳性率均远高于骨软骨瘤组 ( TK1 84%＞0%，Ki67 54%＞15% )，且差异有统计学意义 ( P＜0.01 )。这表明 TK1 与 Ki67 在增殖活跃、异型性大、恶性度高的骨肉瘤细胞中高表达，而在分化良好的低级别良性骨软骨瘤中低表达，从侧面证实了 TK1、Ki67 和肿瘤细胞增殖活跃度相关，均是检测肿瘤细胞增殖活性的良好指标，两者可作为鉴别良、恶性肿瘤的辅助指标，用于骨肉瘤的临床检验工作中。笔者继续对比 TK1 与 Ki67在骨肉瘤中的表达状况，发现 TK1 在骨肉瘤中的表达明显高于 Ki67 ( 84%＞54% )，且差异有统计学意义 ( P＜0.01 )，这提示在骨肉瘤组织中，TK1 的敏感性高于 Ki67，是更优的检验指标。

TK1 与 Ki67 的表达强度与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型等因素无相关性，而与Enneking 分期及局部复发状况相关，说明 TK1 和Ki67 与肿瘤的发生、发展具有一定的联系。肺部是骨肉瘤常见的转移部位，发生肺转移的患者其预后往往较差，本实验结果显示 TK1 阳性表达强度与患者发生肺转移紧密相关，而 Ki67 则无此特性，这表明在评估患者预后方面，TK1 具有一定优势。

随着医学的发展，化疗已成为骨肉瘤治疗的主要手段之一，其在骨肉瘤的综合治疗中有着举足轻重的地位[16]。化疗敏感的骨肉瘤患者其预后明显优于不敏感者[17-18]。化疗药物对恶性肿瘤细胞的重要作用机制之一是诱导其发生凋亡反应，因此观察骨肉瘤组织化疗后的细胞坏死率是预测骨肉瘤患者化疗敏感性的最直接、也是最可靠的指标。肿瘤坏死率高的患者，其化疗有效率往往较高，预后较好[19]。本实验结果显示，50 例骨肉瘤患者中，20 例肿瘤坏死率＜90%，其 TK1 阳性率为 90% ( 18 / 20 )，肿瘤坏死率≥90% 的患者中 TK1 阳性率为 80% ( 24 / 30 )，两者不同表达强度的差异有统计学意义 ( P＝0.028 )，而 Ki67 则无此特性。这表明TK1 表达水平升高会降低化疗后骨肉瘤细胞的坏死率，提示 TK1 的检测或许可以作为预测骨肉瘤化疗敏感性的指标。目前尚无研究指出 TK1 影响骨肉瘤患者化疗敏感性的机制，笔者推测可能与 TK1 参与肿瘤细胞 DNA 的修复或诱导产生化疗耐受有关，具体机制有待今后进一步深入研究。

本实验将骨肉瘤切片染色阳性率＞25% 认为是高表达，结果显示 TK1 高表达组患者中位生存时间显著短于低表达者，而 Ki67 则无此特性，提示 TK1高表达的患者预后较差，TK1 是较 Ki67 更优的判断患者预后状况的指标。这可能是因为增殖活跃的肿瘤组织，其处于 S 期及 G2 期的细胞比例往往较高，而 TK1 恰好在 S 期早期浓度开始升高，至 G2 期浓度达到高峰[3]，因而其高表达提示肿瘤组织增殖活跃，患者预后往往较差。

本研究还分析了患者 3 年生存率与各临床、病理因素的关系。根据单因素及多因素分析发现，骨肉瘤患者 TK1 的表达水平 ( P＝0.002 ) 及是否合并肺转移 ( P＝0.012 ) 是影响其预后的独立危险因素，此结果表明 TK1 的表达水平与患者的预后紧密相关，其具体作用机制尚待进一步深入研究。

本实验提示 TK1 及 Ki67 蛋白的表达均与骨肉瘤的发生发展具有相关性，但 TK1 与骨肉瘤患者临床病理学特征的联系较 Ki67 更紧密，对预后的判断更有价值，是判断骨肉瘤生物学行为及预后的一个更优指标，而且可能是骨肉瘤诊断和治疗的潜在靶点。然而，TK1 在骨肉瘤细胞增殖中的确切作用机制尚未揭示，有待于进一步的深入研究。

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( 本文编辑：裴艳宏 )

Expression and clinical significance of thymidine kinase 1 and Ki67 in osteosarcoma

FU Yu-cheng, ZHENG Chuan-xi, ZHANG Shi-quan, GUAN Hong, LI Wei, TAN Ji-feng. Department of Surgical Intensive Care Unit ( SICU ), the f rst Aff liated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, 310003, China

ZHANG Shi-quan, Email: gukezsq@163.com

ObjectiveTo test the level of thymidine kinase 1 ( TK1 ) and Ki67 in the osteosarcomas, to compare the difference in the clinical features and prognosis.MethodsThe expressions of TK1 and Ki67 in 50 cases of osteosarcoma and 20 cases of osteochondroma tissues were studied by immunohistochemical staining.ResultsThe positive rate of TK1 and Ki67 in osteosarcoma group was 84% ( 42 / 50 ) and 54% ( 27 / 50 ), in osteochondroma group was 10% ( 2 / 20 ) and 15% ( 3 / 20 ), respectively. There was a signif cant difference in the expression of TK1 and Ki67 between the 2 groups. In osteosarcoma group, the positive rate of TK1 was signif cantly higher than Ki67. Both markers had a signif cant correlation in Enneking stage and the local recurrence. But there were no signif cant differences in gender, age, tumor size, and pathological type . Besides, the expression of TK1 was signif cantly different in tumor cell necrosis rate and lung metastasis. The median survival time of TK1 high expression patients ( positive rate ＞ 25% ) was significantly shorter than low expression patients. Univariate analysis showed that local recurrence, Enneking stage, lung metastasis and TK1 expression were the factors inf uencing the prognosis of osteosarcoma patients. Multivariate analysis showed that the expression level of lung metastasis ( P = 0.012 ) and TK1 ( P = 0.002 ) were independent factors inf uencing the prognosis of osteosarcoma.ConclusionsThe expression of Ki67 and TK1 shows signif cant differences in benign and malignant tumors. TK1 is more sensitive than Ki67 in osteosarcoma. TK1 is more related to the clinical and pathology features in osteosarcoma. The expression of TK1 could be a predictor of the prognosis of osteosarcoma.

Osteosarcoma; Immunohistochemical; Thymidine kinase; Ki67; Prognosis

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.02.011

R738.1

深圳市科技计划项目 ( JCYJ20130323111349 )

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院 SICU ( 傅宇成 )；518035 深圳市第二人民医院骨关节骨肿瘤科( 郑传禧、张世权、李伟、谭纪锋 )，病理科 ( 关弘 )

张世权，Email: gukezsq@163.com

2016-07-04 )