猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

罗冰冰 孙鑫鹏 韩先杰（青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）

猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

罗冰冰 孙鑫鹏 韩先杰*（青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 266109）

为了确定引起青岛市某猪场发病的主要病原菌，本试验对该猪场送检的病死猪进行剖检，从肺脏中分离得到一株细菌，随后进行分离菌的形态观察、生化试验、细菌16S rRNA基因测序与药敏试验。结果显示该株分离菌为革兰氏阴性杆菌；生化试验结果表明该株菌分解氨基酸、不分解糖类，与支气管败血波氏杆菌的生化试验结果大致相同；16S rRNA基因序列与支气管败血波氏杆菌(GenBank序列号：AP014582.1)同源性为100%；药敏试验结果表明该株分离菌对部分氟喹诺酮类、氨基糖苷类药物敏感。细菌分离鉴定和药敏试验的结果为猪场发生该病时如何用药治疗提供参考依据。

支气管败血波氏杆菌 分离鉴定 药敏试验

支气管败血波氏杆菌可引起猪发生非进行性萎缩性鼻炎和支气管肺炎[1]，也是猪呼吸道综合征的重要致病因子之一[2]。近年来，随着猪的跨区域引种频繁，以及中国集约化养殖的开展，由支气管败血波氏杆菌引起的呼吸道疾病也随之扩散[3]。2016年3月，青岛市某猪场仔猪发生呼吸道综合征并出现死亡现象，给该养殖场造成较大的经济损失。为了进一步做好该病的防治工作，本研究对病死猪进行了致病菌的分离鉴定与药敏试验，以期为猪场控制该病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某猪场送检的病死猪，无菌采集具有明显病变的肺脏。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂(10×PCR Buffer、dNTPs、

ExTaq酶)、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂、MH琼脂和脑心浸液购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；通用型柱式基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；药敏纸片、细菌微量发酵管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验动物 ICR小白鼠(体重约20g)购自青岛大吴富城养殖有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌操作从病死猪的肺脏中分离细菌，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板，37℃培养

18～24h后观察。挑取单个菌落进行染色、镜检，观察细菌的形态。

1.2.2 生化试验 挑取单个分离菌接种于细菌微量发酵管中，37℃培养18～24h，观察、记录生化反应结果。

1.2.3 16S rRNA基因的PCR扩增 按照通用型柱式基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。参照文献报道的方法合成一对用于扩增细菌16S rRNA基因序列的引物[4]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。以基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系(50μl)包括：10×PCR Buffer 5.0μl，dNTP4.0μl，上、下游引物各2.0μl，DNA模板2.0μl，Ex Taq酶1.0μl，去离子水34.0μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s。72℃延伸1.5min，33个循环；72℃延伸7min；4℃终止反应。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR产物测序与DNA序列分析 纯化、回收PCR产物，送交宝生物工程(大连)有限公司测序，利用NCBI的BLAST工具对分离菌的16S rRNA的基因序列进行同源性比对。

1.2.5 动物试验 将分离菌的纯培养物接种于脑心浸液中37℃培养18～24h，并计算活菌数。选取5只健康ICR小白鼠，每只腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只体重相近的健康ICR小白鼠，每只腹腔注射等量灭菌脑心浸液。小鼠攻毒后连续7天观察临床表现及死亡情况。

1.2.5 药敏试验 按照Kirby-Bauer琼脂扩散法进行分离菌的药敏试验[5]，参照文献报道的方法进行药物敏感性的判定[6]。

2 结果

2.1 细菌分离及形态观察

分离菌株37℃培养18～24h后，在胰蛋白胨大豆琼脂平板上生长出圆形、光滑、米黄色的小菌落。经革兰氏染色、镜检，结果为革兰氏阴性中等大小杆菌，多呈单个排列。

2.2 生化试验结果

该株分离菌生化试验结果见表1。该菌分解氨基酸，不分解糖类，不产硫化氢，枸橼酸盐、脲酶、氧化酶试验为阳性，ONPG、VP、吲哚试验为阴性。与支气管波氏杆菌生化反应结果大致相符[7]。

表1 博检革兰氏阴性细菌鉴定系统生化试验结果

2.3 分离菌16S rRNA基因的PCR扩增

分离菌16S rRNA基因序列的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1500bp左右出现目的条带(附图)，与预期大小相符。

附图 PCR扩增分离菌16S rRNA 基因结果M. DNA标准DL2000； 1. 分离菌；2，阴性对照

2.4 基因测序分析

利用NCBI的BLAST工具与数据库中登录的序列进行了同源性比对分析，结果显示该菌株与序列(GenBank序列号：AP014582.1)同源性为100%，因此可确定分离菌株为支气管败血波氏杆菌。

2.5 动物试验

试验小鼠于接种菌液后出现精神萎靡，食欲、饮欲废绝，被毛杂乱等临床症状，在48h内全部死亡。对照组小鼠在观察期内，全部健康存活。死亡小鼠眼观主要病变为肺脏、肝脏和肠等出血、坏死。取死亡小鼠的肺、肝接种胰蛋白胨大豆琼脂平板，均生长出与原分离菌相同的菌。

2.6 药敏试验

分离菌的药敏试验结果见表2。分离菌对部分氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物高度敏感，对新霉素中介，对利福平、头孢拉定耐药。

表2 分离菌各种药敏纸片的抑菌直径测量结果 (μg、mm)

3 讨论

（1）支气管败血波氏杆菌广泛分布于自然界，可以引起猪萎缩性鼻炎，也可引起猪生长缓慢饲料利用率低，同时其先期感染能够促进其它多种病原的继发感染并造成严重损失[8]。支气管败血波氏杆菌在仔猪群中主要通过呼吸道和飞沫等方式进行传播[9]。本研究的病料来自2016年3月青岛某养猪场的病死仔猪，根据解剖病变结果，进一步结合细菌分离、生化试验和分子生物学技术鉴定，最终确诊为支气管败血波氏杆菌感染，分离菌对小鼠有一定的致病力。药敏试验结果表明分离菌部分氨基糖苷类、氟喹诺酮类药物高度敏感，对新霉素中介，对利福平、头孢拉定耐药。（2）支气管败血波氏杆菌一般要在一系列的诱因作用下才能发病，因此，建议养殖场定期打扫卫生、及时消毒、通风、注意保暖，减少发病的诱因。另外，当猪场发生细菌性疾病时，应当进行药敏试验，选择敏感药物进行交替用药治疗，避免产生耐药性。

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[3] 吴斌, 陈焕春, 何启盖等. 应用乳胶凝集试验进行猪传染性萎缩性鼻炎血清流行病学调查[J]. 中国兽医科技, 2001, 31(6): 21-22.

[4] 陈香碧, 苏以荣, 何寻阳等. 喀斯特原生土壤与退化生态系统土壤细菌群落结构[J]. 应用生态学报, 2009, 20(4): 863-871.

[5] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing(Twenty-Third Informational Supplement) , 2013.

[6] 裴洁.猪支气管败血波氏杆菌分离鉴定及疫苗菌株的生物学特性研究[D]. 武汉：华中农业大学, 2006:17.

[7] 李一经(主编). 兽医微生物学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 192.

[8] 赵战勤, 裴洁, 薛云等. 猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 中国农业科学 2008, 41(12): 4209-4217.

[9] 罗满林. 动物传染病学[M]. 北京: 中国林业出版社, 2013: 236.

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1007-1733(2017)02-0012-02

2016–10–26）

山东省应用型人才培养特色名校建设大学生科技创新项目；山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队养猪生产与环境控制岗位（SDAIT-08-10）；青岛农业大学大学生创业实训项目

*通讯作者