家禽专用抗病毒药物“优净”临床剂量的确定

王玉堃 王尚明 林明明 谷 颖 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250036）

家禽专用抗病毒药物“优净”临床剂量的确定

王玉堃 王尚明 林明明 谷 颖 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250036）

为研究优净对鸡传染性支气管炎的防治效果，确定临床用药剂量。选用SPF鸡胚测定鸡传染性支气管炎病毒标准株M41型的ELD50以确定攻毒剂量；选用19日龄健康雏鸡随机分为8组，分别为预防组、治疗组、阳性对照组与阴性对照组，其中前2组各设高剂量、中剂量、低剂量小组。19日龄时预防组开始用优净，连续5、21d时攻毒，待症状出现24h后，治疗组开始用优净连续5d。期间进行临床观察，测定不同日龄患病雏鸡血清中的IFN-γ与TNF-β质量浓度。临床试验表明，预防组随优净剂量加大，鸡群的发病率逐渐降低；治疗组随优净剂量加大，鸡群的治愈率逐渐提高。对人工感染雏鸡血清中细胞因子含量变化的测定表明，预防组21日龄雏鸡未攻毒时，不同剂量小组的IFN-γ和TNF-β质量浓度与阴性对照组比较均差异显著；在用优净后的25、28日龄，IFN-γ质量浓度显著高于阴性、阳性对照组，但组间差异不显著。治疗组用优净2d后，用药组之间IFN-γ质量浓度无显著差异，但TNF-β质量浓度差异显著；28、30日龄时，IFN-γ、TNF-β的质量浓度均显著升高，并且与阴性、阳性对照组比较差异显著。试验说明优净可以持续诱导产生IFN-γ与TNF-β，发挥了调节免疫机能的作用，从而对机体产生免疫保护，以达到防治鸡传染性支气管炎的效果。根据试验结果，暂定临床推荐剂量为2.0ml/只，2次/d。

鸡传染性支气管炎 IFN-γ TNF-β 优净

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的急性、接触性传染病，在鸡呼吸道具有高度传染性，临床表现症状为：喘气、咳嗽、打喷嚏、气管啰音、流鼻涕。IBV表现不同的组织嗜性，分为呼吸道型、肾型和腺胃型，尤其是肾型传染性支气管炎(肾传支)表现普遍[1～2]。IBV-M41型(IBV-M41)主要引起肾脏以及免疫系统病变，导致肾传支，使水、盐、药物不能正常代谢，从而并发、继发其他疾病；肾传支的病程发展中涉及细胞因子IFN-γ与TNF-β[3～4]。感染IBV-M41鸡体中的大多数CD4细胞与CD细胞均分泌II型IFN(IFN-γ)，而IFN-γ通过诱发Th1细胞的免疫反应，可以保护机体免受细菌感染及病毒感染[3]。肿瘤坏死因子(TNF-β)可以介导免疫调节和抗病毒功能，因而TNF与INF协同作用能激活机体内的抗病毒途径。因此，在人工感染雏鸡血清中IFN-γ与TNF-β的动态变化反映了机体对病毒的作用状态及其变化。本研究参考文献[4]，由IBV-M41造模(起肾传支)，用优净对其治疗，再检验血清中IFN-γ与TNF-β的含量，从免疫学角度探讨优净的防治效果并初步确定临床治疗剂量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及病毒株 SPF鸡为19日龄无IB抗体健康岭南黄雏鸡，购自山东农业大学；试验前喂食无抗全价配合饲料，自由采食及饮水；及时剔除弱雏。饲养至21日龄备用。病毒株：IBV-M41，由中国农业大学何诚教授提供。

1.1.2 药品 优净为4味药材(板蓝根9g、大青叶9g、黄连3g、淫羊藿6g)制成的口服液，其含生药量为1g/ml。

1.1.3 主要试剂与仪器 紫外可见分光光度计(日本岛津)，离心机(长沙湘仪离心机有限公司，TDZ-WS型)，鸡IFN-γ试剂盒与TNF-β试剂盒(美国R&D公司)。

1.1.4 病毒的鸡胚半数致死量(ELD50)测定 将复壮鸡胚病毒液用质量分数为0.9%的生理盐水进行10倍系列稀释，每个稀释度接种6枚10日龄鸡胚，每胚接种病毒液0.2ml。同时设生理盐水对照组。石蜡封孔，在37℃培养1周，每8h照蛋1次，记录鸡胚生死情况：若血管萎缩、胚体卷曲不动，判定为死亡胚；若鸡胚自然增大、血管自然增粗，判定为存活胚。根据文献[5]计算ELD50为10-6.3/0.1ml，本研究以100ELD50/0.2ml的剂量人工感染21日龄雏鸡。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药 （1）选择400只备用鸡雏随机分组，分为预防组、治疗组、阴性对照组与阳性对照组；其中，预防组和治疗组各设高、中与低3个不同剂量的药品组(优净组)每组鸡雏50只，共8组。（2）鸡肾型传染性支气管炎的易感日龄是20～40日龄[6]，本试验选择在21日龄时攻毒(造模)。（3）预防组在攻毒前2d(第19日)开始按高(2.0ml/次)、中(1.0ml/次)与低(0.5ml/次)3个不同剂量分别给供试鸡雏灌服优净，2次/d，连续用药5d，于21、25和28日龄时采血备用；治疗组在攻毒后24h鸡群开始出现症状时，按高(4.0ml/次)、中(2.0ml/次)与低(1.0ml/次)3个不同剂量，分别给供试鸡雏灌服优净，2次/d，连续用药5d，于25、28和30日龄时采血备用；阳性对照组在攻毒后不给任何药物并隔离饲养；阴性对照组则不攻毒、不给药并隔离饲养；对照组的采血时间均为21、25、28和30日龄。

1.2.2 测定IFN-γ和TNF-β质量浓度 每只鸡的采血量均为10mL，血样4℃放置12h后，离心分离血清(2500r/min，15min)。IFN-γ和TNF-β试剂盒操作说明，测定血清中的细胞因子IFN-γ和TNF-β的吸光度，以此计算该2种细胞因子的质量浓度(ng/ml)。

1.2.3 优净治疗效果判定指标与判定 （1）发病率：在试验期间出现咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、呼吸困难、张口喘息等IB典型症状者，判定为发病。发病率 = 发病鸡只数/该组试验鸡总只数×100%。（2）死亡率：在试验期间出现上述IB典型症状并死亡，且尸体剖检可见气管、鼻道内有浆液性、卡他性和干酪样的分泌物，出现气管黏膜增厚、水肿等IB典型病理变化者，判定为感染死亡。死亡率 = 死亡鸡只数/该组试验鸡总只数×100%。（3）保护率：在试验期间，预防组未死亡鸡均判定为保护。保护率 = 未死亡鸡只数/该组试验鸡总只数×100%。（4）治愈率：在试验期间，治疗组病鸡经给药后精神状态、食欲恢复正常，不再出现临床症状者，判定为治愈。治愈率=治愈病鸡只数/该组试验鸡总只数×100%。

1.2.4 统计方法 用SPSS17.0软件进行分析。计量资料以平均值±标准差(Means±SD)表示。P<0.05认为有统计学意义。P<0.05表示差异显著，P<0.0l表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 优净对人工感染IBV-M41雏鸡的预防与治疗效果

2.1.1 预防效果 由表1可以看出，在同一采血时间，人工感染IBV-M41雏鸡血清中的IFN-γ质量浓度均随用药剂量的增加而升高，且均与阴性对照组有显著差异(P< 0.05)，并在28日龄达到极显著水平(P<0.01)，但不同剂量组间差异并不显著(P>0.05)。TNF-β质量浓度的变化规律与IFN-γ的基本相同，但于25日龄时与阴性对照组的差异达到极显著水平(P<0.01)。由此可知，优净可使雏鸡血清中IFN-γ与TNF-β的质量浓度升高，且日龄越大，升高幅度越大。这表明优净对IFN-γ与TNF-β有诱生作用。

表1 优净对预防组人工感染IBV-M41雏鸡血清中IFN-γ和TNF-β变化的影响

2.1.2 治疗效果 （1）由表2可以看出，治疗组中，各用药组雏鸡血清中的IFN-γ质量浓度在25日龄时与阴性对照组比较差异显著(P<0.05)，但显著低于阳性对照组(P<0.05)。阳性对照组雏鸡的IFN-γ质量浓度高于阴性对照组，且差异显著(P<0.05)。说明3个用药组在用药过程中对IFN-γ的影响不大，但IBV-M41对其影响较大，使其质量浓度明显升高(对照组)。28日龄时，3个用药组雏鸡血清中IFN-γ质量浓度显著高于阴性对照组(P<0.05)，且治疗组中高、中剂量组的IFN-γ质量浓度显著高于阳性对照组(P<0.05)；高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)。说明在用药结束后，雏鸡血清中的IFN-γ质量浓度明显升高，药物剂量高低使IFN-γ出现了组间差异。30日龄时，3个用药组雏鸡血清中的IFN-γ质量浓度显著高于阴性、阳性对照组(P<0.05)，说明在用药过程中优净对IFN-γ影响不显著，但是在1个用药周期(5d)结束后对IFN-γ具有明显的诱生作用。（2）由表2还可知，25日龄时，3个用药组雏鸡血清中TNF-β的质量浓度显著高于阴性对照组(P<0.05)，且高、中剂量组与阴性对照组比较达极显著差异水平(P<0.01)，高、中剂量组雏鸡血清中TNF-β的质量浓度也显著高于阳性对照组(P<0.05)，且高剂量组与低剂量组组间差异显著(P<0.05)。28日龄时，3个用药组雏鸡血清中TNF-β的质量浓度均显著高于阴性、阳性对照组(P<0.05)，且高、中剂量组与阴性对照组比较差异显著(P<0.05)。30日龄时，3个用药组雏鸡血清中TNF-β的质量浓度均显著高于阴性对照组，高、中剂量组显著高于阳性对照组(P<0.05)，但组间差异不显著。说明治疗组雏鸡血清中的TNF-β质量浓度明显升高，且高剂量组显著高于低剂量组。

综合以上结果，在治疗试验中，优净对IFN-γ的诱生作用不明显，但TNF-β的质量浓度却明显升高，说明优净有诱生TNF-β的功能。在治疗结束后，IFN-γ和TNF-β的质量浓度显著升高，表明优净可以使IFN-γ和TNF-β的质量浓度持续升高。

表2 优净对治疗组人工感染IBV-M41雏鸡血清中IFN-γ和TNF-β变化的影响

2.2 优净对人工感染IBV-M41雏鸡的临床治疗效果

在预防试验和治疗试验中，用药组鸡群整体精神状态良好，饮水量及采食量基本正常，仅个别鸡只表现出精神沉郁。阳性对照组鸡群精神沉郁，采食、饮水量下降甚至废绝，甩鼻，咳嗽，出现石灰样粪便，试验过程中接近半数死亡。阴性对照组隔离饲养，采食与饮水正常，未见临床变化。剖检发现，治疗组鸡群的肾脏微肿，但无花斑肾出现，输尿管内无尿酸盐沉积，粪便正常。由表3可以看出，预防试验中，随药物剂量增大，鸡群发病率逐渐降低；治疗试验中，随药物剂量增大，鸡群治愈率逐渐提高。说明本研究的优净对感染IBV-M41的鸡群具有较好的防治效果，得出临床推荐剂量为2.0ml/只，2次/d。

表3 优净对人工感染IBV-M41雏鸡的临床治疗效果 (%)

3 讨论

（1）本研究发现，优净对肾型鸡传染性气管炎有一定疗效；用药后雏鸡血清中的IFN-γ和TNF-β的质量浓度明显升高；治疗试验表明，优净能持续诱生IFN-γ和TNF-β，从而对机体产生免疫保护作用。本研究结果与文献[7]结果一致。（2）文献[8]报道体外试验表明，IFN-γ能活化巨噬细胞，通过产生肿瘤坏死因子，如TNF等细胞因子的机制而发挥作用，从而使得TNF的含量也相应增加。文献[3]表明，IFN-γ具有抗病毒和抗增殖活性，能保护细胞免受病毒感染，对正常细胞具有重要的抗增生活性，并能调节体液免疫。文献[4]表明，由IFN-γ诱导产生的TNF可以选择性地溶解感染病毒的细胞以限制病毒繁殖，IFN-γ能与TNF-β协调作用激活体内抗病毒途径。文献佐证本研究中的优净具有抗病毒作用。（3）根据试验结果，选择治疗试验中的中剂量(2.0ml/只)作为临床推荐剂量。

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1007-1733(2017)02-0005-03

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