基因组工程在微生物细胞工厂构建中的应用进展

何庆，王茜，朱清华，方宏清

1.德州学院生命科学学院，德州 253023

2.安徽大学健康科学研究院，合肥 230601

基因组工程在微生物细胞工厂构建中的应用进展

何庆1，王茜1，朱清华1，方宏清2

1.德州学院生命科学学院，德州 253023

2.安徽大学健康科学研究院，合肥 230601

微生物细胞工厂是以可再生资源为原料，通过微生物细胞转化制备人类所需的能源、药物、化工原料等等，或者利用微生物治理日益恶化的环境。应用基因组工程改造目标微生物可以进一步提升其应用潜力，更好地解决当今所面临的健康、能源和环保等问题。简述了目前主要的基因组改造技术及其在构建大肠杆菌、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌细胞工厂中的应用研究进展。

基因组工程；微生物细胞工厂；合成生物学

基因组工程是指为了实现某一目标对复制系统进行有意的、广泛的遗传修饰。目前，人们对基因组工程的研究正处于快速上升时期。以微生物细胞工厂替代传统化工厂，将可再生资源转化为人类所需的能源、药物、化工原料等，是绿色发展的重要途径之一。目前，以基因组工程为基础的微生物细胞工厂的构建主要有两条技术路线：合成简约化的基因组；剔除赘余基因以获得简约化的基因组。第一条技术路线是以人们对生物体系研究所获得的技术与知识为基础，将零部件一步步组建成生物体，重塑生命是其核心思想。第二条技术路线为大多数研究人员所采用，它主要针对遗传背景较为清晰的微生物，通过对其基因组的结构和序列进行分析，分批次敲除非必需或赘余的基因序列，或通过添加DNA序列增加新的功能，提高细胞对底物和能量的利用率以及生产性能。

1 基因组改造技术

基因组靶向编辑指在基因组DNA的预定位点上，精确地改变DNA序列，包括插入、缺失和置换等，进而改变基因的结构或功能。该技术是微生物细胞工厂构建中最常用的技术。

1.1 λ Red同源重组和CRISPR技术

λ Red同源重组是一项可在染色体水平进行遗传操作的技术，只需较短的同源序列，不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程。而CRISPR/Cas9（clustered regularly interspersed short palindromic repeats/Cas9）技术是由RNA指导Cas9蛋白对靶基因进行修饰，具有组成简单、价格低廉、安全性高、切点相对精确、具有可逆性、可同时对多个基因位点进行编辑的优点，被广泛应用在不同微生物中（表1）。

目前，人们致力于将λ Red重组酶与CRISPR/ Cas技术相结合，结合后的系统不仅能够发挥λ Red重组酶高效重组的优点，还利用了CRISPR/Cas识别特异性序列并产生双链断裂的特点。如Reisch等[10]发明的 no-SCAR（scarless Cas9 assisted recombineering）利用λ Red促进供体DNA的基因组整合，然后利用Cas9切割的双链DNA来筛选突变株，可实现无痕基因组编辑。Carlotta等[11]在MAGE技术的基础上结合CRISPR/Cas9与λ Red重组，创造出了一种适用于大肠杆菌的高效快速的基因组工程方法CRMAGE，该方法对3个基因组靶标的重组效率高达96.5%～99.7%。

表1 CRISPR/Cas9技术在不同微生物中的应用

1.2 大片段捕获、合成及组装

DNA片段的克隆和组装技术是分子生物学的重要工具。近年来，随着合成生物学的发展，对大片段的捕获和有效组装显得尤为关键。虽然传统的利用Ⅱ型限制性内切酶连接克隆的策略仍然在发挥着重要作用，但由于酶切位点的限制，其在多DNA片段组装或者平行无缝克隆方面不足之处也尽显无遗[12]。为此，人们基于PCR、非典型酶切连接、单链退火拼接、同源重组等原理，开发出了一系列大片段DNA克隆与组装技术，为微生物细胞工厂的构建提供了有效的操作工具。但这些方法均有其各自的适用范围，还没有一种方法可以在满足快速平行组装（无痕、无序列依赖性、可按预设顺序组装）的同时，适用于生物合成途径乃至基因组的组装。因此，目前最常用的策略是依据目标DNA分子尺度、序列的同源性程度和能否容忍疤痕的存在，将几项最合适的技术联合使用。

一些新方法和新技术的出现，使大片段捕获、合成及组装操作变得简单。如应用Red重组直接从体内克隆染色体上大于10kb的DNA序列非常困难，但朱莹等利用一种抗性拆分-融合策略成功地将供体菌基因组上约48kb的大片段DNA捕获至质粒载体上，并将其移植到了受体菌的染色体上，一次敲除了基因组中4个非必需区，该方法的发明将有利于基因组组装和大片段DNA的功能研究[13]。 Red/ET重组是一种基于体内同源重组的技术，该技术不受限制位点位置和DNA片段大小的限制。Bian等[14]利用RecE/EecT介导的大肠杆菌线性加线性同源重组（linear plus linear homologous recombination, LLHR）从丁香假单胞菌的基因组中直接克隆了syringolin基因簇，并在大肠杆菌中成功地进行了异源表达。Huang等[15]更是将用迭代重组的方法组装得到的多杀菌素基因簇替换了糖多孢菌体内天然红霉素聚酮化合物合酶基因，并获得了成功的表达。

此外，还有许多其他的基因组改造方法，如RNA干扰[16]、PCR介导染色体分裂技术[17]等。

2 基因组工程在不同微生物细胞工厂中的应用

2.1 基因组工程在大肠杆菌细胞工厂中的应用

大肠杆菌是使用最广泛的异源表达宿主菌。各大类天然产物，如非核糖体肽类、聚酮类、苯丙烷类和萜类化合物，都能在大肠杆菌内异源合成。自2002年发表了第一篇大肠杆菌基因组简约化的报道后，关于大肠杆菌基因组精简的报道如雨后春笋。Shalini等[18]构建了一系列可用于单拷贝DNA序列整合或者启动子区置换的模板质粒，如pSD1xx和pSD2xx，并通过实验证明了其有效性。Wei等[19]利用基因组工程方法构建了大肠杆菌突变株DOPA-30N，3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸（L-DOPA）产量在5L发酵罐中60h能够达到8.67g/L。上述研究成果表明，基因组的精简往往能够获得意想不到的优良属性，同时也大大鼓舞了人们构建大肠杆菌细胞工厂的想法。

将λ Red重组与CRISPR/Cas9相结合的策略，不仅能够解决DNA大片段或者代谢途径组装过程中面临的问题，而且已经在很多研究中获得了成功。如Chung等[1]基于上述策略发明了一种大片段基因精确整合的方法，能够将7kb的双链DNA整合到大肠杆菌基因组中，且效率超过了60%。Pyne等[2]开发了一种三质粒方法，不仅能够对短单链寡核苷酸进行高效重组，还能用大片段的PCR产物替换染色体延伸片段上的多基因。上述基因组编辑的方法将在大肠杆菌细胞工厂的构建中发挥越来越重要的作用。

2.2 基因组工程在酿酒酵母细胞工厂中的应用

酿酒酵母是代谢工程中应用最广泛的模式生物之一，是人们研究细胞周期、蛋白质相互作用的首选模式生物。酵母细胞工厂对于真菌和植物来源的次级代谢途径有良好的适应性，然而质粒拷贝数控制不佳和对持续选择压力的需求限制了其在工业发酵上的稳定性。因此，更多先进的基因组编辑技术在酵母中使用并获得了成功。如Murakami等[17]通过分析酿酒酵母染色体基因，利用PCR介导染色体分裂技术，获得了缺失531.5kb的基因组简化菌株，其乙醇和甘油产量分别是野生株的1.8倍和2倍。

目前，人们已经能够利用CRISPR/Cas9系统对酵母菌进行基因插入和敲除。Bao等[3]开发了HICRISPR（homology-integrated CRISPR-Cas） 技 术并首次在酿酒酵母内一步成功敲除了CAN1、LYP1和ADE2基因。Shi等[4]研制出Di-CRISPR（delta integration CRISPR-Cas）平台，利用该平台可实现无痕的多基因整合，甚至完整代谢途径的整合将成为可能。

总之，同源重组技术结合CRISPR/Cas9技术后，将成为无痕、一步基因敲除与整合、多基因生物合成途径组装的强有力的工具。再通过利用灵巧的多gRNA克隆表达元件，将来一定能够为人们提供稳定性更强的工程化的酵母基因组[20]。

2.3 基因组工程在链霉菌细胞工厂中的应用

链霉菌细胞工厂的优点主要体现在3个方面：①作为多种次级代谢产物的产生菌，链霉菌体内丰富的初级代谢途径可以提供充足的前体供应；②链霉菌具有独特的转录后修饰系统，如磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶催化的反应是Ⅰ型聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）及非核糖体肽合成酶（nontibosomal peptide synthetase, NRPS）中关键的蛋白修饰；③如果在链霉菌自身优良特性的基础上，能够利用基因组工程开发出培养条件、遗传操作和生长速度接近大肠杆菌的突变株，将成为合成生物学领域的标志性成果[21]。因此，全世界的科学家一直对链霉菌基因组工程的研究情有独钟。

目前，链霉菌细胞工厂的构建主要包括以下几种策略：基因组的精简和优化、对各类调控子进行改造和增加前体供应。在此基础上，人们已开发出阿维链霉菌、天蓝链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌和委内瑞拉链霉菌等链霉菌底盘宿主。Wang等[22]以链霉菌FR008为初始菌株，经过遗传改造后获得了一系列优势底盘，这些底盘遗传操作非常容易，且是目前常见链霉菌中生长速度最快的。

CRISPR/Cas9技术的出现能够解决链霉菌基因组编辑过程费时费力的难题。人们已经用Ⅱ型CRISPR/Cas系统在变铅青链霉菌、白色链霉菌和产绿色链霉菌中成功地进行了多基因的缺失，编辑效率大于70%[5]。如Cobb等[6]利用含有嵌合gRNA的pCRISPomyces-2系统不仅高效地完成了单基因和双基因的敲除，还实现了30kb大基因簇的缺失。Hu等[23]将CRISPR/Cas9和CodA（sm）组合后，发明了能够快速、高效地编辑链霉菌基因组的CRISPR/ Cas9-CodA（sm）系统。Huang等[24]构建了一个适合链霉菌基因操作的高效CRISPR/Cas9基因组编辑质粒pKCcas9dO。相信在未来，随着类似于CRISPR/ Cas的技术在链霉菌中广泛应用，将诞生更多性能优越的链霉菌宿主，为链霉菌细胞工厂的构建以及新药的研制提供强有力的支持。

2.4 基因组工程在枯草芽孢杆菌细胞工厂中的应用

枯草芽孢杆菌是工业生产中许多生物制品的宿主菌。作为一种底盘细胞，人们已经致力于用多种基因组工程的方法对其基因组进行精简以提高它的性能和适用性。如Toya等[25]构建的纤维素酶产生菌MGB874精简了约20.7%的基因组，在生产碱性纤维素酶和蛋白酶时表现出了明显的优势。除了能够生产多种酶类之外，枯草芽孢杆菌还可以用来生产一些小分子化学物质，如核苷、核黄素、2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇等。Li等[26]对枯草芽孢杆菌168的基因组进行了581.9～814.4 kb的精简，构建了多株突变株，发现它们在生长速率、产孢率、转化效率等方面呈下降趋势。但重新引入外源基因后，鸟嘌呤和胸腺嘧啶产量分别是野生株的4.4倍和5.2倍。

新的基因组编辑技术在枯草芽孢杆菌中的应用也日益增多。如Josef等[7]构建了一个可用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的单质粒系统，成功地敲除了枯草芽孢杆菌染色体上的两个大片段，并对枯草芽孢杆菌168中的trpC2基因突变进行了修复。Westbrook等[8]建立了一套综合改造枯草芽孢杆菌的CRISPR/Cas9工具包。因此，我们有理由相信，随着更多先进的基因编辑技术的应用，将大大推动枯草芽孢杆菌工厂的构建进程。

2.5 基因组工程在乳酸菌细胞工厂中的应用

乳酸菌具有良好的生物安全性，是公认的安全级微生物。人们已经完成了多种乳酸菌基因组的测序，发现同其他微生物一样，其基因组内含有大量的非必需基因。目前，大部分乳酸菌基因组简化研究尚不成熟，基因敲除技术还依赖于传统的同源重组技术，其敲除策略大致可分为3类：位点特异性重组、同源单交换基因敲除和线形DNA重组基因敲除[27]。

位点特异性重组体系由重组酶和特异性识别位点组成，该系统具有高度的专一性和保守性。Cre/ loxP系统和TP901-1/att系统常用于乳酸菌的位点特异性重组。如Qiao等[28]把质粒pNZ5319转化入乳酸乳球菌进行同源重组，随后引入Cre/loxP系统消除筛选标记，成功敲除了胸腺嘧啶合成酶基因thyA。由于乳酸菌含有一层较厚的细胞壁，导致对其进行遗传操作较困难，重组效率一般较低，但仍然可以通过优化相关因素（如引入反向筛选标记和利用温敏复制子）提高敲除效率。Langa等[29]利用敲除载体pORI28（repA-）和温敏质粒pVE6007（repA+）共同敲除短乳杆菌pdh30基因，发现该基因参与3-羟基丙酸的生物合成。

CRISPR/Cas技术未来极有可能在乳酸菌中得以广泛应用。van Pijkeren等[9]已尝试把CRISPR/Cas系统和单链重组系统结合后应用于乳酸菌中。Millen等[30]从遗传水平对CRISPR/Cas系统在乳酸菌细胞内的有效性进行了研究，结果表明CRISPR/Cas系统在乳酸菌内部有效且应用前景广阔。此外，ZFNs和 TALENs等高效靶向基因修饰技术都有待应用于乳酸菌中，这将极大地提高基因敲除效率，为乳酸菌细胞工厂的构建提供强有力的工具。

3 总结与展望

利用微生物细胞工厂生产化工和医药产品具有高效、清洁、附加值高等优点，已成为绿色工业发展的核心部分。特定环境下，维持细胞正常代谢所需的最小基因群构成了该细菌的最小基因组。Masaomi等[31]对缺失了不同赘余基因组序列大小的大肠杆菌突变株的生长情况进行了分析，发现它们的指数增长率和饱和细胞密度按照与缺失长度成正比的方式下降，并且该现象与培养基无关。因此，如何在保证微生物基本正常生长的条件下，利用最小基因组作为底盘构建相应的微生物细胞工厂，是需要进一步研究的问题。在对不同微生物基因组的精简过程中，CRISPR/Cas9系统因其独特的优势成为当前的研究热点。

目前，虽然有很多活性化合物及其衍生物在微生物细胞工厂中成功进行了异源表达，但同时也发现了一些令人费解的现象[32]。如Smanski等[33]曾尝试在S. lividans K4-114、S. coelicolor（CH999、M1146、M1154）和S. albus J1074中对平板霉素基因簇进行异源表达，但只在S. lividans中获得成功，且是在敲除了途径特异性调控基因ptnR1之后，导致这一结果的原因尚不清楚。因此，一方面需要对合成代谢途径的调控系统及其底盘适配性的问题进行深入研究，另一方面，由于任何一种微生物包含的代谢途径不能够满足所有天然产物异源表达的需求，故开发性能优良且各具专长的底盘细胞尤为紧迫。

随着基因组工程技术的日新月异，将诞生更多优良的超级微生物细胞工厂，它们遗传操作快速高效、本底代谢竞争途径少、培养条件简单、标准化元件充足、异源化合物提取分离方便、稳定且高产，将为新药研发和天然化合物产业化提供更强大的支持。

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Application progress of genome engineering for construction of microbial cell factories

HE Qing1，WANG Qian1，ZHU Qinghua1，FANG Hongqing2

1. College of Life Science, Dezhou University, Dezhou 253023, China
2. Institute of Health Science, Anhui University, Hefei 230601, China

Microbial cell factories（MCFs）apply microbial cells to transform renewable resources to produce energy, medicines, f ne chemicals and so on, or to remedy for the environment. To modify the microorganisms by genome engineering can further improve the MCFs’application potentiality and resolve the healthy, energy and environmental issues faced by the society. This paper describes the main genome modif cation technology and its application in construction advnced MCFs based on Escherichia coli, yeast, Streptomyces, Bacillus subtilis and Lactobacilli.

genome engineering; microbial cell factories; synthetic biology

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.005

方宏清，博士，安徽大学兼职讲席教授。研究方向：微生物基因工程药物、微生物基因组工程及合成生物学。E-mail：fanghongqing@vip.sina.com

国家“973”计划项目（2011CBA00800），国家自然科学基金面上项目（课题编号81373286）