啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进

2017-02-24 20:11陈学周毕意辉张可可张明凯
安徽农学通报 2016年2期

陈学周++毕意辉++张可可++张明凯++尤涛

摘 要:目的:通过对新生啮齿类海马神经元的分离和培养,尝试建立一个简单、稳定、高效的啮齿类海马神经元原代培养方法,为脊髓损伤的相关分子机制研究提供目的细胞。方法:取新生SD乳鼠的海马组织,通过低浓度胰酶消化制成细胞悬液、4h差速贴壁后使用无血清Neurobasal培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫荧光对海马神经元相关微管蛋白-2(MAP2)行特异性染色,结合DAPI核染色鉴定神经元。结果:该方法培养的海马神经元生长状态良好,纯度较高。结论:采用低浓度胰酶消化,差速贴壁及无血清培养啮齿类海马神经元符合体外细胞实验要求,为进一步研究提供良好的目的细胞。

关键词:海马神经元;低浓度胰酶;差速贴壁;无血清培养

中图分类号 Q42 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2016)02-06-03

Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons

Chen Xuezhou1 et al.

(1 The Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022,China)

Abstract:Obejctive:To established a simple, effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro, and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods:The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low concentration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope, the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results:The hippocampal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion:Using low concentration of trypsin, differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro, so as to provide targeted cells for further research.

Key words:Hippocampal neurons;Low concentration of trypsin;Differantial adherence;Serum-free medium

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱外科一种致残率很高的疾病,易造成患者运动功能障碍,大小便失禁甚至终身瘫痪[1]。现代研究表明,脊髓损伤后,经历第一次原发性损伤及第二次继发性损伤,二次损伤是继发性,是可以预防和治疗的,其重点在于保护残存神经元的功能[2]。建立简单、稳定、高效的神经元体外培养是在细胞水平研究脊髓损伤的重要物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 出生24h内SD乳鼠,雌雄不限,由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Neurobasal培养基、B27无血清添加剂、GlutaMAX-I添加剂、DMEM(high glucose)培养基、灭活胎牛血清、0.25%胰酶、台盼蓝染液均购自Invitrogen公司,多聚-D-赖氨酸、DPBS、Hanks液、抗荧光淬变封片液购自碧云天公司,DNase I、DAPI、Triton X-100购自sigma公司,神经元相关微管蛋白-2(MAP2)、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)购自abcam公司。

1.1.3 主要器材 24孔细胞培养板、15mm细胞爬片、超净工作台、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜、手术解剖显微镜

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 种植培养液:含90%DMEM+10%灭活胎牛血清。维持培养液:98%Neurobasal培养基+2%B27无血清添加剂+0.5mMGlutaMAX-I添加剂。

1.2.2 细胞爬片及细胞培养孔板处理 将灭菌的15mm细胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液浸泡,室温孵育2h,吸弃多聚-D-赖氨酸溶液,蒸馏水洗2遍,晾干待用。

1.2.3 海马神经元的分离 取出生24h内SD乳鼠,75%酒精消毒后断头,依次剪开皮肤、颅骨,迅速取出脑组织置于冰上含有预冷Hanks液的培养皿中。在手术显微镜下分离出两侧的海马区,彻底剥离脑膜及血管。用剪刀剪成约1mm3大小,加入预热的0.05%胰酶,放入37℃消化15min(每7min稍微摇晃一下)。小心吸走消化过组织,用2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化,加入100μLDNase I,混匀后使用1mL枪头上下轻柔吹打15下,静置2min,吸取上清液。再像沉淀的组织团块中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基及100μL DNase I,重复上述吹打步骤。吸取上层细胞悬液,如此重复2次。70μm细胞筛过滤,1000r/min离心5min弃上清,使用种植培养基重悬,吸100μL细胞悬液后加入100μL台盼蓝染液,于血球计数器下计数细胞,调整细胞密度至2×105个/mL,每孔加入1mL,十字摇板数次,放入培养箱内。以上操作确保在2h内全部完成。4h后使用无血清DMEM培养基洗板镜检细胞碎片基本去除后,换成Neurobasal培养基,后每2d半量换液。

1.2.4 神经元细胞鉴定 取体外培养7d的海马神经元细胞爬片,吸出培养基,PBS洗1次,加入1mL预热多聚甲醛溶液,确保神经突不被破坏,室温孵育10min。PBS洗1次,0.1%Triton X-100通透膜10min。加入10%山羊血清孵育1h后,加入1%血清稀释的MAP2(1∶500),4℃湿盒孵育过夜。加入1%血清稀释的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000),室温避光孵育1h。DAPI复染5min后,将细胞爬片反转放至滴有抗荧光淬灭封固液的干净载玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封载玻片边缘,激光共聚焦显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 细胞形态的观察 刚接种细胞分散,呈圆形透亮。4h后细胞已贴壁,部分细胞已伸出短小轴突。1~2d后,细胞明显增大,突起延伸,形成稀疏网络。在培养过程中,神经元之间的纤维联系逐渐丰富,并形成网络。5~7d神经元在倒置显微镜下可见具有明显的光晕,此时神经元胞体呈三角形、椭圆形或多边形,边界清楚,胞体明亮,立体感增强(图1、图2)。

3 讨论与结论

神经元是脑及脊髓组织中最基本的组成成分,对神经系统功能的发挥着主要的作用,是脑及脊髓损伤中最常用的细胞,其培养和鉴定技术亦是神经生物学研究中最基本的技术。但是连续的神经元细胞系因无法形成典型的轴突、树突及突触而得不到广泛应用,而原代培养的神经元比传代细胞系更加接近在体状态,是研究工作中较佳的目的细胞,得到了广泛应用。

理论上,原代神经元的培养可通过大脑任何部位及脊髓获取,但海马部位较其他部位神经细胞成分简单,含量多,拥有典型的细胞表型[3-4]。传统方法多采用胎鼠进行海马神经元的培养[5-6],其神经分化程度低,便于培养,但由于操作复杂,如进行雌雄鼠配种,计算胎龄,实验时间不可控制,取材时胎鼠表面羊水过多,海马较小等导致操作要求高。而采用乳鼠较胎鼠具有较多的优点,可按照实验按需处死一至数只实验乳鼠,取材较胎鼠简单,无需担心缺氧对胎鼠脑神经元的损害。

在海马神经元培养的过程中,很多因素都会影响原代海马神经元培养的质量,如收集细胞过少,接种时死细胞比例过高,杂细胞过多等,其对实验条件的要求较普通细胞更高。首先,除了消化以外,其他操作均在冰上操作,从解剖至接种细胞控制在2h内完成,尽量减少组织细胞代谢。解剖时,在手术显微镜下尽可能去除海马组织表面所有的血管膜,以免消化后被迫吹打,导致接种时死细胞及杂细胞比例过高。其次,组织在消化前用剪刀剪碎,并使用低浓度0.05%胰酶加适量DNA酶,作用时间控制在15min左右,低浓度胰酶消化能力相对温和,死细胞较少,从而避免使用木瓜酶现用现配的缺点。DNA酶可分解消化过程死细胞释放出来的DNA,避免组织缠结,吹打过程可收获更多单细胞悬液。吹打时,采用分步吹打,慢吸慢吹,动作轻柔,保证每一个单细胞都避免过度吹打,尽可能多地收集细胞。再次,使用含10%灭活胎牛血清重悬、接种细胞,其血清成分可促进细胞生长、增殖,4h后换成含B27添加剂的Neurobasal培养基,换液前轻微震荡,可将多数贴壁不牢固的胶质细胞及细胞碎片去除。含B27添加剂的Neurobasal培养基其成分确定,培养出的细胞状态均一,选择性促进神经细胞生长,而胶质细胞几乎不分裂。最后,接种板也是决定实验成败的关键因素,接种板密度过低,神经元突触形成过少,无法利用自身分泌促生长因子,同时胶质细胞分裂过多,难以存活和成熟。密度过高,营养相互争夺,细胞容易抱团生长,均会导致实验失败。本实验胶质细胞含量较少,未使用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,因阿糖胞苷加入时间及剂量难以控制,毒性较大,除了抑制胶质细胞外,对正常海马神经元亦有毒害作用。

综上所述,采用低浓度胰酶消化,差速贴壁及无血清培养新生SD乳鼠海马神经元的方法简单、稳定、高效,可得到高密度的符合体外实验要求的细胞,为神经系统损伤的研究提供了良好的目的细胞。

参考文献

[1]Kirchberger I,Sinnott A, Charlifue S, et al.Functioning and disability in spinal cord injury from the consumer perspective:an international qualitative study using focus groups and the ICF[J].Spinal Cord.,2010,48(8):603-613.

[2]Stirling DP, Yong VW.Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry[J].J Neurosci Res.,2008,86(9):1944-1958.

[3]Calabrese B, Halpain S.Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology[J].Neuron.,2005,48(1):77-90.

[4]Williams ME, Wilke SA, Daggett A, et al.Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus[J].Neuron.,2011,71(4):640-655.

[5]Kaech S, Banker G.Culturing hippocampal neurons[J].Nat Protoc.,2006,1(5):2406-2415.

[6]Fath T, Ke YD, Gunning P,et al.Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons[J].Nat Protoc,2009,4(1):78-85.

(责编:张宏民)