Pyk2、Twist及MMP—7在肝细胞癌中的表达及临床意义

左凯　薛栋　孔丽　夏修良

【摘要】 目的：檢测肝癌组织中富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）、Twist和基质金属蛋白酶-7（MMP-7）的表达，并分析它们相互之间的关系及其临床意义。方法：应用免疫组织化学法检测80例肝癌组织及癌旁肝组织中Pyk2、Twist及MMP-7蛋白的表达情况，分析其与临床病理因素的关系。结果：Pyk2在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为71.3%、12.0%，差异有统计学意义（P<0.05）；Twist在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为66.3%、6.0%，差异有统计学意义（P<0.05）；MMP-7在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为68.8%、8.0%，差异有统计学意义（P<0.05）。Pyk2阳性表达与肝癌病理分级、分化程度、血管侵犯及TNM分期明显相关（P<0.05），Twist阳性表达与肝癌病理分级、分化程度、血管侵犯及TNM分期明显相关（P<0.05），MMP-7阳性表达与肝癌病理分级、分化程度、血管侵犯及TNM分期明显相关（P<0.05）。肝癌组织中，Pyk2与Twist表达呈正相关（P<0.05），Pyk2和MMP-7表达亦呈正相关（P<0.05），Twist和MMP-7表达亦呈正相关（P<0.05）。结论：Pyk2、Twist和MMP-7蛋白的表达水平在肝癌组织中与肿瘤组织的分化程度、病理分级、血管侵犯及临床TNM分期等均有关。因此，临床联合检测Pyk2、Twist和MMP-7对肝癌患者的预后判断具有重要意义。

【关键词】 肝细胞癌； 富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2； Twist； 基质金属蛋白酶-7； 免疫组织化学

Expression and Signifance of Pyk2，Twist and MMP-7 in Hepatocellular Carcinoma/ZUO Kai，XUE Dong，KONG Li，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：045-048

【Abstract】 Objective：To study the expressions and their clinical significance of Pyk2，Twist and MMP-7 in hepatocellular carcinoma.Method：The expressions of Pyk2，Twist and MMP-7 proteins were tested by immunohistochemistry in 80 cases of hepatocellular carcinomas and adjacent paracancerous tissues.Result：The positive rate of Pyk2 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that of adjacent paracancerous tissues（71.3% vs 12.0%，P<0.05）.Significant differences were also observed in the expression rate of Twist between the patients with hepatocellular carcinomas and paracancerous tissues（66.3% vs 6.0%，P<0.05）.The positive rate of MMP-7 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that of adjacent paracancerous tissues（68.8% vs 8.0%，P<0.05）.The differences of the expression of Pyk2 in hepatocellular carcinoma of pathological grading，tumor differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were significant（P<0.05）.The differences of the expression of Twist in hepatocellular carcinoma of pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were also significant（P<0.05）.The differences of the expression of MMP-7 in hepatocellular carcinoma of pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage were also significant（P<0.05）.Significantly positive correlation was found between Pyk2 and Twist by using spearman correlation analysis（P<0.05）.There was positive correlation between Pyk2 and MMP-7 （P<0.05）.There was positive correlation between Twist and MMP-7（P<0.05）.Conclusion：The expressions of Pyk2，Twist and MMP-7 are related to the pathological grading，differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage，and their combined detection can help estimate the outcomes of the patients.

【Key words】 Hepatocellular carcinoma； Proline-rich tyrosine kinase-2； Twist； MMP-7； Immunohischemistry

First-authors address：The Peoples Hospital of Binzhou City，Binzhou 256610，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.012

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统较常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。近年来，尽管肝癌的治疗方法和技术取得了很大的进步，但其总的5年生存率没有显著提高，局部复发和转移是其主要原因[1]。因此，寻找有效的分子靶点一直都是肝癌靶向治疗的研究热点。富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，是粘着斑激酶 （focal adhesion kinase，FAK）家族的一个新成员，在肿瘤细胞增殖、侵袭转移等过程中发挥重要作用[2]。国内外研究已证实，Pyk2在神经胶质细胞瘤[3]、非小细胞肺癌[4]、膀胱癌[5]等肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤分期及转移密切相关。Twist基因是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）转录因子家族的一个重要成员，Twist与肿瘤侵袭、转移密切相关[6]。基质金属蛋白酶-7（MMP-7）是存在于细胞外基质中的一类蛋白水解酶，能够降解细胞外基质，在肿瘤细胞增殖、侵袭及转移中发挥重要作用[7]。本研究采用免疫组织化学（EnVision）方法观察Pyk2、Twist及MMP-7在肝癌中的表达并探讨其临床肿瘤学意义，为临床判定肝癌恶性程度、选择治疗方式及评价预后提供一定的理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究通过滨州市人民医院伦理委员会批准，选取2006年2月-2012年2月滨州市人民医院肝细胞癌手术切除临床标本，共80例，其中配对癌旁组织（距离癌组织边缘<3 cm）50例。男56 例，女24例，年龄33～79岁；53例肿瘤直径<5 cm，27例肿瘤直径≥5 cm。所有标本病理诊断均为原发性肝细胞癌，术前未接受过放、化疗等抗肿瘤治疗，依据2010年国际抗癌联盟分期标准：Ⅰ、Ⅱ期共51例，Ⅲ、Ⅳ期共29例。

1.2 试剂与方法 选取病理科存档的肿瘤组织蜡块，病理科医师重新切片诊断，进一步行病理学分级，分别实施Pyk2、Twist和MMP-7免疫组织化学染色，应用免疫组化检测Pyk2、Twist和MMP-7蛋白的表达。兔抗人Pyk2单克隆抗体、兔抗人Twist多克隆抗体及兔抗人MMP-7多克隆抗体（均购自美国Santa Cruz公司），工作浓度均为1∶200。EnVision试剂盒（购自丹麦Dako公司），操作步骤按试剂盒说明书进行。同时设立阳性和阴性对照：阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片，磷酸盐缓冲溶液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.3 判定标准 Pyk2蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒；Twist蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色颗粒；MMP-7蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色颗粒。在不知任何背景资料的情形下，由两位病理专家采用双盲法进行阅片。首先依据染色强度打分：无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分（染色需与背景着色相比较）。再将阳性细胞所占的百分比进行打分：无阳性细胞记为0分，阳性细胞所占百分比（1%～25%）记为1分，阳性细胞所占百分比（26%～50%）记为2分，阳性细胞所占百分比（51%～75%）记为3分；阳性细胞所占百分比（76%～100%）记为4分。最后将染色强度与阳性细胞百分比乘积打分，≥4分记为免疫反应阳性，<4分记为免疫反应阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，等级相关检验采用Spearman。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中Pyk2、Twist、MMP-7表達的比较 Pyk2阳性染色主要位于细胞质，细胞核未见明显染色，染色为棕黄色或棕褐色，小片状或弥漫性分布。两者Pyk2阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。Twist蛋白的阳性着色位于细胞质，染色为棕黄色颗粒。两者Twist阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。MMP-7蛋白的阳性着色主要位于细胞质，染色呈棕黄色或棕褐色颗粒。两组MMP-7阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.2 Pyk2、Twist和MMP-7蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系 肝癌中Pyk2阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。Pyk2蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及临床TNM分期均有关（P<0.05）。肝癌组织中Twist阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。Twist蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及临床分期均有关（P<0.05）。肝癌组织中MMP-7阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及AFP等均无关（P>0.05）。MMP-7蛋白阳性表达与病理分级、肿瘤分化程度、血管侵犯及临床分期均有关（P<0.05）。Pyk2、Twist及MMP-7共同高表达伴随肝癌组织分化程度降低、病理分级差及血管侵袭。见表2。

2.3 Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌组织中表达的关系 Spearman等级相关分析发现，肝癌组织中Pyk2与Twist蛋白表达呈正相关（r=0.425，P=0.032），Pyk2与MMP-7的表达亦呈正相关（r=0.498，P=0.026）；Twist与MMP-7的表达亦呈正相关（r=0.302，P=0.041）。

3 讨论

Pyk2（proline-rich tyrosine kinase 2）是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8号染色体 （ 8p21.1），基因全长4.048 kbp，在脑、肠、脾及肾等多种组织中有表达。Pyk2依赖于钙离子浓度的变化而被激活，调控细胞增殖、分化及侵袭[8-10]。Pyk2能诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化，促进腫瘤细胞侵袭和迁移[11]。本研究发现，Pyk2在肝癌组织中高表达，Pyk2在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁肝组织（P<0.05），提示Pyk2基因与肝癌的发生、发展有关。进一步研究还发现Pyk2阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床分期密切均相关，提示Pyk2能在肝癌细胞分化、侵袭转移过程中发挥重要作用。

Twist是一个新发现的细胞内转录因子，不仅在胚胎形态发生中起关键作用，还参与调控肿瘤细胞增殖分化、侵袭转移等过程[12]。胰腺癌中Twist高表达，并且与肿瘤分期、侵袭转移密切相关[13]。沉默Twist基因后结直肠癌细胞增殖及迁移力显著下降[14]。本研究结果表明，Twist在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁肝组织（P<0.05）；并且Twist阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床TNM分期均有关（P<0.05），提示Twist在肝癌侵袭转移过程中发挥重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表达明显增强，进一步支持了Twist参与了肝癌恶性进展，这与车娜等[15]研究报道相一致。相关性分析表明，Pyk2与Twist在肝癌中的表达呈正相关（P<0.05），提示Pyk2与Twist共同参与了肝癌恶性侵袭，推测Pyk2可能通过上调Twist促进了肝癌侵袭及转移。

基质金属蛋白酶-7（MMP-7）是一种胶原蛋白酶，当MMP-7表达上调，细胞间的黏附力下降，促进肿瘤细胞侵袭及转移[16-18]。MMP-7在食管癌及乳腺癌组织中高表达，其表达与临床分期及淋巴结转移均密切相关[19-20]。本研究结果显示，MMP-7在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁肝组织（P<0.05）。MMP-7阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床TNM分期均有关（P<0.05）。以上结果表明MMP-7与肝癌侵袭转移密切相关。本研究还发现Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌组织中异常表达，并且三者密切相关，提示Pyk2、Twist和MMP-7在肝癌侵袭转移过程中发挥了协同作用。

综上所述，本研究发现肝癌组织中Pyk2、Twist和MMP-7表达均与肿瘤病理分级、临床分期、肿瘤分化程度及血管侵袭密切相关，提示Pyk2、Twist和MMP-7与肝癌的发生发展和侵袭转移有关。因此，联合检测Pyk2、Twist和MMP-7有助于预测肝癌的局部侵袭及转移，同时也可以作为评估肝癌患者预后的新指标。

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（收稿日期：2016-11-16） （本文编辑：程旭然）