白细胞介素10和γ干扰素基因表达在大鼠肝移植排斥反应诊断中的意义

张杰　张环　唐滔　李康　阎玉矿

【摘要】 目的：研究探讨白细胞介素10和γ干扰素基因表达在大鼠肝移植排斥反应诊断中的意义。方法：以成年、健康的二级雌性SD大鼠、Wistar大鼠为研究对象，体重为（250±20）g，實施肝移植手术，术后采用RT-PCT技术对大鼠白细胞介素10（IL-10）和γ干扰素基因（IFN-γ）表达进行检测，并以组织病理学结果为急性排斥反应的诊断标准，将大鼠分为排斥组与非排斥组，对比观察两组大鼠的IL-10与血清IFN-γ含量及移植肝脏内IL-10与IFN-γ基因表达情况。结果：同系移植组肝移植后肝细胞、组织、结构轻微变化，同种异体移植组则变化显著，严重紊乱。同系移植组血清IL-10含量最高，显著高于同种异体移植组与对照组（P<0.05）；同种异体移植组IFN-γ含量最高，显著高于同系移植组与对照组（P<0.05）。同系移植组肝脏IL-10 mRNA表达水平显著高于对照组与同种异体移植组（P<0.05）；同种异体移植组IFN-γmRNA表达水平显著高于对照组与同系移植组（P<0.05）。结论：大鼠肝移植手术后发生排斥反应的IL-10表达显著降低，IFN-γ表达显著增高，两者表达的变化可作为早期诊断肝移植术后急性排斥反应的诊断指标，为临床诊断提供依据。

【关键词】 肝移植； 大鼠； IL-10； IFN-γ

Significance of Gene Expression of Interleukin 10 and γ Interferon in the Diagnosis of Rejection in Rat Liver Rransplantation/ZHANG Jie，ZHANG Huan，TANG Tao，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：017-020

【Abstract】 Objective：To study and probe into the significance of gene expression of interleukin 10 and γ interferon in the diagnosis of rejection in rat liver transplantation.Method：The adult and healthy two female SD rats and Wistar rats were selected as research objects，the body weight was （250±20）g，liver transplantation was carried out，and the expression of interleukin 10（IL-10） and γ interferon gene（IFN-γ） was detected by

RT-PCT after operation，and according to the diagnostic criteria of acute rejection were studied by histopathological results，the rats were divided into rejection group and non rejection group.Then，the contents of IL-10 and serum IFN-γ and the expression of IL-10 and IFN-γ in liver transplantation of two groups were compared.Result：After liver transplantation，the liver cells，tissues and structures in the isograft group were slightly changed，and the allograft group were changed significantly，and the serious disturbance.The level of serum IL-10 in the isograft group were significantly higher than those of the allograft group and the control group（P<0.05）.The content of IFN-γ in the allograft group was highest，which was significantly higher than those of isograft group and the control group（P<0.05）.The expression level of mRNA IL-10 in liver in the isograft group was significantly higher than those in the control group and the allograft group（P<0.05）.The expression level of IFN-γ mRNA in liver in the allograft grou was significantly higher than those in the control group and the isograft group（P<0.05）.Conclusion：The expression of IL-10 is significantly decreased after liver transplantation in rats，and the expression of IFN-γ is significantly increased，and the changes of expression of IL-10 and IFN-γ could be used as a diagnostic index for early diagnosis of acute rejection after liver transplantation.

【Key words】 Liver transplantation； Rat； IL-10； IFN-γ

First-authors address：Longgang Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.005

肝移植已經成为了肝脏外科手术的成熟技术，对大部分的终末期肝病患者来说是唯一一种有效治疗方式[1]。通过免疫治疗剂的应用获得一定的成功，但是因浸润淋巴细胞、单核细胞与其他炎症细胞所造成的急性排斥反应仍然是肝移植术后患者生存的危险因素[2]。相关研究显示，在排斥反应中IFN-γ对移植物损伤有支配作用，同时还受到其他因子的影响，如IL-10等[3-4]。基于此，本研究探讨了IL-10和IFN-γ基因表达在大鼠肝移植排斥反应诊断中的意义，为早期诊断肝移植术后急性排斥反应提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 以成年、健康、活泼的二级雌性SD大鼠、Wistar大鼠（SPF级）为研究对象，体重为180～250 g，平均（230±20）g，所有大鼠均从广州中医药大学实验动物中心购买，许可证号SCXK（粤）2013-0034。均饲养在清洁、恒温的环境下，维持12 h昼夜节律，按照实验动物管理与使用原则进行。供体与受体大鼠在术前禁食8～12 h，自由饮水。

1.2 试剂与仪器 APC Rat Anti-Human IL-10（货号554707）和APC Rat Anti-Mouse IFN-γ（货号554413）均来源于BD Biosciences公司；总蛋白提取试剂盒（货号37901）、RNA提取试剂盒（货号74104）、QIAamp DNA Mini Kit（51304）均来源于Qiagen公司。10%多聚甲醛、光学显微镜、冷冻离心机、凝胶成像系统、超低温冰箱等。

1.3 方法 对大鼠进行肝移植，采用改良Kamada二袖套法[5]，不进行静脉分流。受体体重略高于供体体重。实验分组：（1）对照组，选正常SD大鼠，仅将腹部正中切开，单纯行胆道外引流，然后关腹，术后与移植组处理相同；（2）同系移植组，供体和受体均为SD大鼠；（3）同种异体移植组，SD大鼠为受体，Wistar大鼠为供体。每组10只（指手术成功排除术后腹腔感染出血，引流管脱落、细菌培养呈阳性，最终用于实验统计的大鼠）。术后7 d将大鼠处死，采集样本并检测[6]。

手术操作：（1）供体手术。术前0.5 h给予大鼠皮下注射0.02 mg阿托品，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg），于腹正中位置切口进腹，静脉注射2 mL肝素生理盐水（经阴茎背静脉注射），将肝脏向下牵引。对第二肝门实施解剖：肝脏周韧带进行游离，将左膈肌静脉缝扎。对肝下下腔静脉进行解剖，将切断的右肾上腺静脉进行结扎。游离右肾肝下下腔静脉，游离右肾静脉结扎切断。进行第一肝门解剖：对胆总管游离，剪开前壁，插入胆管支架管到肝侧，用5-0丝线进行固定，对胆管远端离断。分离结扎并将肝固有动脉切断，游离肝门静脉到脾静位置进行结扎然后剪断。适当注入15 mL灌注液，经肝门静脉对肝脏灌洗，速度控制在3～4 mL/min，低压，避免肝脏肿胀。在左肾静脉以下将下腔静脉剪断，让灌洗液流出，使供肝在短时间内达到冷缺血状态。灌注的同时对胃底向左侧微微牵拉，将肝食管韧带内血管交通支充分暴露，然后结扎切断，等到肝脏变为土黄色以后将肝下下腔静脉、门静脉剪断，尽可能的留长残端。对肝轻轻下牵，使用眼科剪将肝上下腔静脉剪下，避免有膈肌组织。将肝取出放置在0～4 ℃保存液。修整供肝：建立起肝下下腔静脉、门静脉袖套管，然后使用7-0带针线对肝上下腔静脉左侧、右侧缝吊1针。（2）受体手术：于术前0.5 h给予大鼠皮下注射0.02 mg阿托品，吸入乙醚，麻醉后卧位固定，背部垫高，采用供体相同切口，对肝周韧带进行游离，靠近膈肌将左膈肌静脉结扎切断。第一肝门分离出胆总管：结扎切断胆总管，分离肝固有动脉然后实施结扎切断，将门静脉至左右支分叉处分离。对肝下下腔静脉实施分离，连同软组织进行肾上腺静脉结扎。离断肝后韧带到达膈下，将肝下下腔静脉用血管夹阻断。采用Satinsky钳贴膈肌夹闭肝上下腔静脉，将肝上下腔静脉、门静脉左右分支与肝下下腔静脉剪断，取出受体肝脏。原位肝移植：将供体肝取出并置于原位，对位置进行适当调整，7-0预置缝线连续缝合然后开房等到肝上下腔静脉，各叶轻拨复位，避免肝叶充盈不均或者出现瘀血，无肝期结束。

1.4 观察指标

1.4.1 病理学观察 取大鼠右前叶肝组织，使用10%多聚甲醛进行固定，24～48 h后进行脱水、透明与包埋切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察[7]。

1.4.2 血清IL-10和IFN-γ含量检测 从下腔静脉无菌采集2 mL血样，将血清分离，使用ELISA试剂盒检测，操作按照试剂盒说明进行[8]。

1.4.3 移植肝脏IL-10和IFN-γ基因表达检测 提取肝组织mRNA，采用RT-PCT技术对大鼠白细胞介素10（IL-10）和γ干扰素基因（IFN-γ）表达进行检测，β-actin为内参照基因，采用凝胶成像系统照相，采用Bio-Image分析系统进行半定量测定，计算目的条带吸光度/内参区带比值，为目的mRNA相对含量[9]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后病理检测结果比较 同系移植组10只大鼠肝脏细胞有轻度变性浊肿，组织结构出现轻度缺血再灌注损伤，血窦轻度充血扩张，胆管上皮细胞结构正常，肝小叶结构基本正常。同种异体移植组肝细胞变性严重，坏死肝细胞多，血窦出现显著充血扩张，可见汇管区、中央静脉周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，累及肝实质，胆管有明显炎症，胆管上皮细胞有胞浆空泡变性、甚至脱落、消失，肝小叶结构严重紊乱。

2.2 各组血清IL-10和IFN-γ含量比较 同系移植组血清IL-10含量最高，显著高于同种异体移植组与对照组（P<0.05）；同种异体移植组IFN-γ含量最高，显著高于同系移植组与对照组（P<0.05）。见表1。

2.3 移植肝脏IL-10和IFN-γ基因表达检测结果 同系移植组肝脏IL-10 mRNA表达水平显著高于对照组与同种异体移植组（P<0.05），同种异体移植组IFN-γmRNA表达水平显著高于对照组与同系移植组（P<0.05），见图1。

3 讨论

现阶段，在肝移植术后移植物丧失功能的主要原因在于肝移植排斥反应[10]。肝移植手术患者术后约有65%在1年内发生急性排斥反应，出现慢性排斥或者不可逆损伤[11]。急性排斥多发生在肝移植术后数天到数月，其中发生在1个月的比例占到了80%～90%[12]。排斥反应涉及到免疫调节因子与效应细胞，是机体内部诸多细胞共同作用的结果[13]。排斥反应以局部组织炎症为主，表现为炎性细胞浸润、缺血再灌注损伤、促炎因子出现聚集、实质细胞坏死等[14]。尽管临床上运用多种手段来抑制排斥反应的发生，如供体特异性抗原输注、免疫抑制剂以及供刺激分子阻断等，但是肝移植排斥反应的发生率仍较高[15-16]。

移植肝活检组织病理学得到了广泛地应用，是当前用于诊断肝移植术排斥反应最可靠的方法，但是对移植肝会造成一定损伤[17]。在免疫学与分子生物学的检查技术的应用发展下，分子生物学用于急性排斥反应诊断得到应用，国外已检测到肝移植急性排斥中多种细胞因子的表达[18]，但结果不尽相同，存在较大的差别，对急性排斥反应的诊断价值也并未确定。所以对无创性、特异性与敏感性较好的肝移植急性排斥反应诊断方法进行探索是非常重要的。

Th1/Th2型细胞因子的动态平衡在免疫排斥/耐受中起着重要的调节作用。IFN-γ与IL-2由Th1型细胞所分泌，对同种抗原特异性细胞毒T淋巴细胞与迟发型超敏反应具有促进作用，进而启动排斥反应，IL-4与IL-10由Th2型细胞分泌，主要参与体液免疫，在移植耐受中起到了重要的作用。

IFN-γ对Th1细胞的分化具有促进作用，同时抑制Th2型细胞的增殖与分化，诱导促炎因子分泌，诱发炎症因子的各种效应[19]。研究发现，IFN-γ对巨噬细胞进入移植物具有诱导作用，激活巨噬细胞，增加CTL的活性，并上调移植物的MHC表达量，促使血管内皮细胞表面的黏附因子表达，对排斥反应有促进作用。通过本研究发现，同种异体移植组IFN-γ含量、IFN-γmRNA表达水平最高，强于同系移植组。

人类IL-10基因位于1号染色体，约195 kbp，包含有外显子5个，IL-10受体基因启动子中有诸多的单核苷酸多态性位点，对其介导的免疫反应具有影响。诸多研究证实，IL-10对排斥反应具有抑制作用，主要机制在于对Th1型细胞的增殖、相应细胞因子分泌具有抑制作用，包括抑制TH1型细胞分泌IL-12、IL-2、与IFN-γ；可抑制T淋巴细胞激活；抑制单核巨噬细胞活化等；抑制Th2型细胞产生IL-4、IL-5等。胡维昱等[9]对肝移植患者术后3个月内的外周血与穿刺组织采用免疫组织化学法、酶联免疫吸附法对IL-10表达进行了检测，发现无排斥的患者表达量更高，发生急性排斥患者則表达量减少。本研究结果发现，同系移植组血清IL-10含量、IL-10表达水平最高，同种异体移植组与之相比更弱。研究结果与前者一致，认为IL-10对排斥反应有抑制作用、免疫耐受。但是也有相关研究发现，IL-10对T淋巴细胞增强具有刺激作用，会增加移植物血管病，促进排斥反应发生[20]。因此IL-10表达对肝移植术后急性排斥反应的影响还有待进一步的研究。

综上所述，大鼠肝移植手术后发生排斥反应与IL-10、IFN-γ表达具有相关性，两者表达的变化可作为早期诊断肝移植术后急性排斥反应的诊断指标，为临床诊断提供依据。

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（收稿日期：2016-11-09） （本文编辑：程旭然）