小鼠糖尿病肾病足细胞NOD2 mRNA表达变化及其意义

宁晋灵，高颖

(1天津医科大学基础医学院，天津300070；2天津市南开区三潭医院)

小鼠糖尿病肾病足细胞NOD2 mRNA表达变化及其意义

宁晋灵1,2，高颖1

(1天津医科大学基础医学院，天津300070；2天津市南开区三潭医院)

目的 观察糖尿病肾病(DKD)小鼠足细胞中细胞核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2) mRNA的表达变化，并探讨其意义。方法 将分化完全的小鼠足细胞接种至6孔板，分为DKD组和NC组。DKD组分别加入25、50 mmol/L的膜过滤葡萄糖溶液刺激24 h制备DKD足细胞模型；NC组不给予糖刺激。采用实时荧光定量PCR法检测两组细胞中的NOD2 mRNA。选取上一实验中筛选出的最适浓度葡萄糖刺激足细胞制作DKD模型，分为胞壁酰二肽(MDP)组、shRNA组和模型组。MDP组给予2 g/mL的MDP刺激，shRNA组转染NOD2 shRNA，模型组常规培养，24 h后采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中的NOD2、nephrin、肿瘤坏死因子α(TNF-α) mRNA。结果 DKD组细胞中NOD2 mRNA相对表达量高于NC组，DKD组中50 mmol/L亚组NOD2 mRNA相对表达量高于25 mmol/L亚组(P均<0.05)。MDP组细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量高于模型组，nephrin mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)；shRNA组细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量低于模型组，nephrin mRNA相对表达量高于模型组(P均<0.05)。结论 DKD小鼠足细胞中NOD2 mRNA表达上调，NOD2 mRNA高表达时足细胞损伤加重，NOD2 mRNA低表达时足细胞损伤减轻；NOD2 mRNA表达变化可能与DKD的发病及病情进展有关。

糖尿病肾病；足细胞；细胞核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2；nephrin；肿瘤坏死因子α；动物实验

随着研究不断深入，糖尿病肾病(DKD)被认为是一种由固有免疫系统参与的、有大量免疫细胞及炎症介质浸润的炎症反应。nephrin是足细胞内信号通路的关键调节因子，其基因表达下调可导致肾损伤及蛋白尿出现，nephrin表达水平可反映肾脏结构性变化[1]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)由肾脏固有细胞等合成，通过生成活性氧簇影响正常肾小球血流、破坏肾小球滤过功能，其水平可反映肾损伤程度[2]。细胞核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)是模式识别受体(PRRs)NOD蛋白家族中的一员[3]，研究[4]显示，NOD2基因敲除的DKD小鼠模型肾脏损伤程度减轻。胞壁酰二肽(MDP)是目前体外实验发现的NOD2的惟一特异性激动剂[5，6]。考虑到足细胞病理改变始发于DKD最早期[7,8]，而NOD2与足细胞的关系鲜有报道，故本研究观察了DKD小鼠足细胞中NOD2 mRNA的表达变化，及其对足细胞损伤程度(以nephrin、TNF-α mRNA表达变化表示)的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 小鼠足细胞由苏州北纳创联生物技术有限公司提供(编号BNCC337685)。实时荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad Cycler System公司产品。所用shRNA由江苏南通百奥迈科生物科技有限公司构建。MDP购自湖北鸿运隆生物科技有限公司。

1.2 DKD足细胞中NOD2 mRNA表达观察 将分化完全的足细胞接种至6孔板，分为DKD组和NC组。DKD组分别加入25、50 mmol/L的膜过滤葡萄糖溶液刺激24 h制备DKD足细胞模型，发现足细胞足突融合，即判定符合DKD的早期病理改变，模型制作成功[9]；NC组不给予糖刺激。采用实时荧光定量PCR法检测两组细胞中的NOD2 mRNA，以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。每组实验重复6次。观察DKD组足细胞足突融合情况，筛选最佳葡萄糖作用浓度用于后续实验。

1.3 NOD2 mRNA表达变化对DKD足细胞损伤的影响观察 将DKD足细胞模型(“1.2”实验中选取的最佳作用浓度的葡萄糖刺激足细胞获得)分为MDP组、shRNA组和模型组。MDP组给予2 g/mL的MDP刺激24 h；shRNA组依据文献[10]方法转染NOD2 shRNA 24 h；模型组常规培养24 h。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中的NOD2、nephrin、TNF-α mRNA，每组实验重复6次。

2 结果

2.1 DKD足细胞中NOD2 mRNA的表达变化 25、50 mmol/L葡萄糖刺激的DKD组足细胞中NOD2 mRNA相对表达量分别为1.82±0.15、2.78±0.20，NC组为1.00±0.00，其中DKD组NOD2 mRNA相对表达量高于NC组，DKD组中50 mmol/L亚组NOD2 mRNA相对表达量高于25 mmol/L亚组(P均<0.05)。故后续实验选用50 mmol/L的葡萄糖。

2.2 NOD2表达变化对DKD足细胞损伤的影响 MDP组足细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量高于模型组，nephrin mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)；shRNA组足细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量低于模型组，nephrin mRNA相对表达量高于模型组(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组细胞中NOD2、nephrin、TNF-α mRNA表达比较

注：与DKD组相比，*P<0.01。

3 讨论

几乎所有的多细胞生物体都存在由固有免疫系统介导的机体免疫应答反应，炎症反应和免疫应答反应同样贯穿肾脏疾病的发生发展过程。NOD是PRRs中的一大家族成员，其中最受关注的NOD2包含2个Caspase募集区域(CARD)，可识别肽聚糖中的MDP并因此被激活，导致NF-κB活化，启动致炎因子转录并导致炎症反应[11]。NOD2除表达于炎症细胞外，也存在于其他组织细胞中[12]。NOD2与DKD相关性的报道并不多见，但考虑炎症反应在DKD的发生发展中发挥关键作用，且NOD2承接着固有免疫系统及炎症反应的进行，因此我们推测NOD2在DKD发病中发挥一定作用。

蛋白尿是DKD最早期的临床表现，而作为肾小球滤过膜组成部分的足细胞可通过调节足突细胞骨架蛋白表达阻止蛋白尿的生成。nephrin在维持足细胞完整性及肾小球滤过屏障正常生理功能中发挥重要作用，可协调足细胞外信号向裂孔隔膜肌动蛋白细胞骨架的传递过程。大量研究结果显示，nephrin基因突变可导致严重的蛋白尿及肾损伤，且合并蛋白尿的患者均伴有该基因表达下调。此外，肾足细胞与胰岛素相互应答反应的过程需要依赖nephrin的调控，若nephrin基因沉默可使足细胞在糖摄取时丧失对胰岛素的敏感性[13,14]，使得胰岛素无法重构足细胞骨架蛋白，造成足细胞胰岛素抵抗及糖中毒，破坏足细胞生理功能，形成蛋白尿。因此，我们认为nephrin可在一定程度上反映DKD早期病理生理变化。TNF-α在炎症反应中有广泛的调节联动功能，可诱导NF-κB激活，增加INF-γ、IL-1、CRP等炎症因子及趋化因子的合成[15]，启动、维持炎症反应的进行[16]。相关研究[17，18]显示，TNF-α可激活Caspase家族信号通路，进一步上调NOD2表达。

本研究采用高糖刺激建立DKD小鼠足细胞模型，发现高糖刺激可诱导肾足细胞形成DKD病理改变，并导致NOD2 mRNA高表达，且呈现一定浓度依赖性，推测NOD2 mRNA高表达可能与DKD的发病有关。我们选择50 mmol/L的葡萄糖用于后续实验制作DKD模型，通过检测nephrin、TNF-α mRNA，观察NOD2表达上调或下调对DKD足细胞损伤的影响。本研究结果显示，MDP组足细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量高于模型组，nephrin mRNA相对表达量低于模型组，提示随NOD2表达上调，肾足细胞功能减弱，炎症反应亢进；shRNA组足细胞中NOD2、TNF-α mRNA相对表达量低于模型组，nephrin mRNA相对表达量高于模型组，提示随着NOD2表达水平下调，足细胞功能改善，炎症反应减轻[19]。NOD2可介导炎症反应，并通过某种机制负调节nephrin基因表达，进而导致DKD早期病理生理改变。

结合上述研究结果，我们推测，DKD早期发病机制为：机体第一道免疫防线受到刺激，NOD2被激活并通过活化的NF-κB启动早期炎症反应，释放炎症因子，其中TNF-α对NOD2有正向调节作用[18]，致炎症反应持续发展；与此同时，受到炎症影响的肾足细胞生理结构和功能发生改变，加之NOD2的负向调节，nephrin蛋白表达受抑制，下调足细胞对胰岛素的敏感性，导致足细胞胰岛素抵抗及高糖反应，肾小球滤过功能受损，最终形成蛋白尿。NOD2可能是DKD早期足细胞病理改变的诱导因素之一。有学者[20]指出，糖尿病相关肾损害在糖尿病前期阶段就已经发生，这一发现将早期诊断DKD的重要性提到了更高层面。我们认为，NOD2在DKD的早期诊断方面可能有重要价值，且有望成为DKD的治疗靶点。

[1] Welsh GI, Saleem MA. Nephrin-signature molecule of the glomerular podocyte[J]. J Pathol, 2010, 220(3):328-337.

[2] Sugimoto H, Shikata K, Wada J, et al. Advanced glycation end products-cytokine-nitric oxide sequence pathway in the development of diabetic nephropathy: aminoguanidine ameliorates the overexpression of tumour necrosis factor-α and inducible nitric oxide synthase in diabetic rat glomeruli[J]. Diabetologia, 1999,42(7):878-886.

[3] Magalhaes JG, Sorbara MT, Girardin SE et al. What is new with Nods[J]. Curr Opin Immunol, 2011,23(1):29-34.

[4] Du P, Fan B, Han H, et al. NOD2 promotes renal injury by exacerbating inflammation and podocyte insulin resistance in diabetic[J]. Kidney Int, 2013,84(2):265-276.

[5] 吕青山,李峰,曹琳,等.胞壁酰二肽对人主动脉内皮细胞炎症因子表达影响的研究[J].海南医学院学报,2013,19(7):919-923.

[6] Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors.[J]. Nat Immunol, 2010,11(5):373-384.

[7] Pagtalunan ME, Miller PL, Jumping-Eagle S, et al. Podocyte loss and progressive glomerular injury in type II diabetes[J]. J Clin Invest, 1997,99(2):342-348.

[8] Gunter W, Sheldon C, Ziyadeh FN. From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease: podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J]. Diabetes, 2005,54(6):1626-1634.

[9] 安玉,刘志红.糖尿病肾病病理改变与预后的关系[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2013,22(4):368-372.

[10] 金龙,杨宏宇,杨辉俊,等.NOD2上调自噬抑制舌鳞癌细胞增殖和迁移[J].实用空腔医学杂志,2015,31(3):352-356.

[11] Fritz JH, Ferrero RL, Philpott DJ, et al. NOD-like proteins in immunity, inflammation and disease[J]. Nat Immunol, 2006,7(12):1250-1257.

[12] Mathieson PW. The podocyte as a target for therapies-New and old[J]. Nat Rev Nephrol, 2011,8(1):52-56.

[13] Coward RJ, Welsh GI, Yang J, et al. The human glomerular podocyte is a novel target for insulin action[J]. Diabetes, 2005,54(11):3095-3102.

[14] Coward RJ, Welsh GI, Koziell A, et al. Nephrin is critical for the action of insulin on human glomerular podocytes[J]. Diabetes, 2007,56(4):1127-1135.

[15] Lim AK, Tesch GH. Inflammation in diabetic nephropathy[J]. Mediators Inflamm, 2012,2012:146154.

[16] 赵凯,钱月慧,程晓东,等.动脉粥样硬化闭塞兔动脉TNF-mRNA、NF-κB mRNA表达的变化[J].辽宁中医杂志,2012,39(11):2302-2305.

[17] 丘创华,侯敢,黄迪南.TNF-α信号传导通路的分子机理[J].中国生物化学与分子生物学报,2007,23(6):430-435.

[18] Rosenstiel P, Fantini M, Brautigam K, et al. TNF-alpha and IFN-gamma regulate the expression of the NOD2 (CARD15) gene in human intestinal epithelial cells[J]. Gastroenterology, 2003,124(4):1001-1009.

[19] Toyoda M, Najafian BY, Caramori M, et al. Podocyte detachment and reduced glomerular capillary endothelial fenestration in human type 1 diabetic nephropathy.[J]. Diabetes, 2007,56(8):2155-2160.

[20] Melsom T, Schei J, Stefansson VT, et al. Prediabetes and risk of glomerular hyperfiltration and albuminuria in the general nondiabetic population: A prospective cohort study[J]. Am J Kidney Dis, 2016,67(6):841-850.

·作者·编者·读者·

《山东医药》对医学名词及术语的一般要求

医学名词应使用全国科学技术名词审定委员会公布的名词。中医临床诊疗术语、经穴部位、耳穴名称与部位等应遵循相应的国家标准。对于没有通用译名的名词术语，在文内第一次出现时应注明原词。中西药名以最新版《中华人民共和国药典》和《中国药品通用名称》(均由中国药典委员会编写)为准。英文药物名称则采用国际非专利药名。在题名及正文中药名一般不得使用商品名，确需使用商品名时应先注明其通用名称。冠以外国人名的体征、病名、试验、综合征等，人名可以用中译文，但人名后不加"氏"(单字名除外，例如福氏杆菌)；也可以用外文，但人名后不加“′s”。文中尽量少用缩略语。已被公知公认的缩略语可以不加注释直接使用，例如：DNA、RNA、HBsAg、PCR、CT、MRI等。不常用的、尚未被公知公认的缩略语与一级原词过长在文中多次出现者，若为中文可于文中第一次出现时写出全称，在圆括号内写出缩略语；若为外文可于文中第一次出现时写出中文全称，在圆括号内写出缩略语。不超过4个汉字的名词不宜使用缩略语，以免影响论文的可读性。西文缩略语不得拆开移行。

高颖(E-mail: 120818667@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.013

R3

A

1002-266X(2017)03-0045-03

2016-01-18)