α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件的筛选与优化

林波 刘坤 朱明月 李伟 董栩 李孟森

（海南医学院海南省肿瘤发生与干预重点实验室，海口 571199）

α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件的筛选与优化

林波 刘坤 朱明月 李伟 董栩 李孟森

（海南医学院海南省肿瘤发生与干预重点实验室，海口 571199）

旨在筛选及优化α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs）共结晶的条件，得到高分辨率的共结晶晶体。在昆虫表达系统中分泌表达海兔乙酰胆碱结合蛋白（Ac-AChBP），并用凝胶色谱进行纯化，把纯化的乙酰胆碱结合蛋白与α-芋螺毒素GIC共结晶，利用结晶机器人及HAMPTON RESEARCH 结晶试剂盒进行结晶及结晶条件的筛选与优化。结果显示，在0.6 mol/ L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的条件下生长的晶体较好，其分辨率可以达到2.1 Å。筛选与优化结晶条件（Ammonium citrate dibasic的摩尔浓度及0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate的pH值）可以得到高分辨率的α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶晶体。

α-芋螺毒素GIC；乙酰胆碱结合蛋白；共结晶；结晶条件优化

α-芋螺毒素是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的拮抗剂，而乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs）与nAChRs 的胞外配体结合结构域同源性较高，AChBPs与nAChRs的药理特性和离子通道激活机制相似，因此AChBPs 通常作为研究nAChRs的结构模板［1，2］。多个AChBPs的x-ray结构已被解析，通过其晶体结构，我们更清楚了解nAChRs的结构。AChBPs有3种，分别是Lymnaea stagnalis、Aplysiacalifornica、Bulinus truncatus， 简 称 为Ls-AChBP、Ac-AChBP、Bt-AChBP，它们结构相类似［3，4］，α-芋螺毒素主要与Ac-AChBP 结合。α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶结构不仅帮助我们剖析 nAChRs的生理和病理功能，而且有助于发现药效更好的α-芋螺毒素［4，5］。

目前已有5个α-芋螺毒素与AChBPs共结晶结构被解析，它们分别是PnIA（A10L D14K）（PDB：2BR8）［5］、ImI（PDB：2C9T，2BYP）［6，7］、TxIA（A10L）（PDB：2UZ6）［8］、BuIA（PDB：4EZ1）和GIC（PDB：5CO5）［9］与Ac-AChBP共结晶的结构。其中GIC与Ac-AChBP的复合物结构是我们报道的分辨率较高的共结晶结构。α-芋螺毒素GIC是从杀手芋螺（Conus geographus）中发现的作用于α3β2 nAChRs的毒素。α3β2 nAChRs是位于脑部的神经受体，与记忆、认识相关。α-芋螺毒素GIC作用于α3β2 nAChRs的IC50 最低浓度为1.1 nmol/L，是目前发现最强作用于α3β2 nAChRs的毒素，这一点使它的结构与功能倍受关注，另外，它与Ac-AChBP结合的IC50值也较低（29 nmol/L），它与Ac-AChBP的共结晶的方法可为其他新型α-芋螺毒素与Ac-AChBP或nAChRs共结晶提供借鉴，为开发治疗疼痛、成瘾、帕金森症、阿尔茨海默氏症和癫痫等与nAChRs相关疾病的药物提供理论依据［9］。

蛋白结构的解析关键是要获得高分辨率的蛋白晶体。要获得高质量的蛋白晶体，必须对蛋白结晶条件进行筛选与优化［10-12］。蛋白结晶过程通常是把沉淀剂（池液）加到蛋白质溶液表面，沉淀剂从蛋白质溶液中吸走水分而引起蛋白结晶。结晶条件是指不同的沉淀剂及其摩尔浓度、pH值等因素。这些条件（因素）有上万种，因此需要利用机器人进行对结晶条件的大量筛选和优化，才能得到分辨率高的晶体。本研究采用正交实验，并利用机器人及HAMPTON RESEARCH试剂盒对α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件进行筛选与优化，以期获得高分辨率的晶体。

1 材料与方法

1.1 材料

Ac-AChBP（AChBP from Aplysia californica） 基因［13］根据NCBI 提供的序列（NM_001204599）设计并由上海生工公司合成，在两端分别引入BamH I、Xho I酶切位点。大肠杆菌宿主菌DH10Bac，昆虫表达载体 pFastBac1，昆虫细胞Sf9（Spodoptera frugiperda），HAMPTON RESEARCH结晶试剂 盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，SaltRX等由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表达与纯化 在昆虫细胞中分泌表达Ac-AChBP，分泌表达的培养基上清液经镍柱纯化后，用凝胶色谱进一步纯化。本实验所用凝胶色谱柱是 superdex200（GE Healthcare），利用 AKTA（GE Healthcare）系统分离纯化，流动相HBS溶液（10 mmol/L Hepes，150 mmol/L NaCl，pH7.2）流速为1 mL/min，将蛋白样品浓缩到1 mL后上样，利用AKTA程序过柱，自动收集样品。将收集样品利用SDS-PAGE检测，并用液氮速冻后置于 -80℃保存［13-16］。

1.2.2 α-芋螺毒素GIC的合成与纯化 α-芋螺毒素GIC由上海吉尔生化公司合成，并用C18柱（Vydac，Hesperia，CA，USA）经高效液相色谱纯化，收集纯化的样品（与标准品比较达到99.8%）冷冻干燥备用［9］。

1.2.3 Ac-AChBP蛋白结晶 将纯化的Ac-AChBP浓缩至约20 mg/mL。使用液-液扩散法在291 k长晶体。具体如下：在96孔板中，用HAMPTON RESEARCH试剂PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Cystal Screen，SaltRX当池液，用结晶机器人CRYSTAL GRYPHON（Art robbins instrusmets）点样，将浓缩蛋白液与池液按1∶1点坐滴，点样量为0.15 μL，在显微镜下观察晶体生长［9］。

1.2.4 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶 α-芋螺毒素与 Ac-AChBP 共结晶前，先把它们混合，然后把混合好的溶液去点晶体。已知1 mol Ac-AChBP亚基与1 mol α-芋螺毒素结合（虽然理论上它们按摩尔比1∶1结合，但为了使α-芋螺毒素能充分结合到Ac-AchBP中，把α-半螺毒素的量增加了10倍）。利用ExPASy Protparam tool分析Ac-AChBP吸光指数为1.5，其分子量为27 kD，取出Ac-AChBP蛋白储备液（浓度为1.0 mg/mL）1 mL。按以下公式计算Ac-AChBP蛋白亚基储备液的mol数为：

α-芋螺毒素GIC的C端已酰胺化，其分子量为1 610.4 kD，用纯化的α-芋螺毒素GIC重量除以其分子量可得到GIC的摩尔数。 把α-芋螺毒素GIC按摩尔比为10∶1与Ac-AChBP亚基共混。把混和液在室温放置2 h使其结合，然后13 000 r/min离心15 min，再用凝胶色谱纯化。收集Ac-AChBP与α-芋螺毒素结合的凝胶纯化色谱峰片段，将其浓缩至约20 mg/mL。使用坐滴蒸气扩散法在291 k长晶体，点完晶体后，在显微镜下观察到晶体生长［13-16］。

2 结果

2.1 Ac-AChBP的制备

在昆虫细胞中分泌表达Ac-AChBP，并用凝胶色谱纯化。Ac-AChBP的凝胶纯化色谱（图1-A）显示，其出峰位置在12.5 mL，根据Superdex200柱的说明，峰位置为12.5 mL表示约为135 kD的相对分子量。从不同的峰位置a-d收集组分作进一步的SDSPAGE胶分析（图1-B）。图1-B中a-d是Ac-AChBP蛋白非变性的SDS-PAGE胶图，即上样时，没有加还原剂和煮沸样品。Ra-Rd所示是变性的SDSPAGE胶图，即上样时，加还原剂DDT和煮沸样品5 min。a-d条带在SDS-PAGE胶顶部（图1-B），显示它们非变性状态是五聚体，因为其是球状蛋白，电泳图只显示分子量为116 kD，比实际线型分子量（135 kD）要小。R a-d所示是变性的Ac-AChBP，其由五聚体变为单体，分子量约为27 kD；正好是表达出来的重组蛋白五聚体分子量的1/5，这一点也说明变性的Ac-AChBP状态为单体。活性状态为五聚体。

图1 凝胶色谱（A）和SDS-PAGE（B）分析Ac-AChBP蛋白

2.2 Ac-AChBP结晶及优化

在研究α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件之前，先研究Ac-AChBP的结晶条件。原因是共结晶中Ac-AChBP是个五聚体的大蛋白，而α-芋螺毒素GIC只结合在Ac-AChBP上的小多肽。因此Ac-AChBP结晶的条件是研究共结晶的前提。Ac-AChBP结晶条件可以借鉴在共结晶中。

利用机器人初步筛选Ac-AChBP的结晶，选用结晶试剂盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，Wizard 1，SaltRX均能得到晶体，把得到的晶体送往上海同步辐射光源收集数据，SaltRX的4个条件（表1和图2）得到的晶体分辨率较好。在这4个条件中，15号（图2-A）晶体条件得到的晶体数据最好，分辨率为3 Å。

表1 SaltRX试剂盒筛选出来长晶体的条件

接着对15号晶体条件进行优化，优化实验设计如表2所示，对36个结晶条件进行实验（两因素，六水平），并把得到的晶体送去收集数据，其中最好的晶体数据分辨率为2.4 Å，其生长条件为：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6。

图2 SaltRX试剂盒初步筛选得到晶体

表2 SaltRX的15号结晶条件优化因素及水平

2.3 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶

2.3.1 α-芋螺毒素与Ac-AChBP结合 得到2.4 Å的Ac-AChBP晶体后，进一步研究其与α-芋螺毒素共结晶，共结晶前，先把它们共结合，结合的方法按1.2.4所示，α-芋螺毒素与Ac-AChBP结合后，用凝胶色谱纯化。图3-A蓝线显示Ac-AChBP与α-芋螺毒素GIC结合的凝胶纯化色谱，红线是结合前的Ac-AChBP。图中蓝线比红线分子量大，说明Ac-AChBP已与α-芋螺毒素GIC结合。图3-B是收集图3-A蓝线峰组分进行SDS-PAGE 胶分析，条带1是活性五聚体Ac-AChBP结合α-芋螺毒素GIC，其分子量显示为100-130 kD之间。而条带2是变性的蓝线组分，变性后，五聚体Ac-AChBP变为单体，分子量为27 kD。变性后，α-芋螺毒素GIC也解离出来，显示在SDS-PAGE胶底部。

图3 凝胶色谱（A）、SDS-PAGE胶（B）分析α-芋螺毒素和Ac-AChBP结合

2.3.2 α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶 收集以上共结合的凝胶色谱片段（蓝线峰部分），用机器人去点样长晶体，结晶池液采用优化Ac-AChBP晶体所得的的条件：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6，也得到α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶的晶体，但由于受α-芋螺毒素GIC的影响，其晶体长得不如Ac-AChBP好，还需进一步优化。

优化采用以上优化Ac-AChBP的方法（表2），即改变不同沉淀剂的浓度和pH值，以期获得高质量晶体。表2优化条件下长出的共结晶晶体如图4所示（遴选），把优化条件下长出来的晶体送往上海同步辐射光源收集数据，其中最好的共结晶数据分辨率为2.1 Å，晶体如图5所示，其生长条件为0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。收集一套完整的数据，经HKL2000 处理后数据其他指标也较好。

图4 共结晶条件优化得到的晶体（遴选）

图5 优化的α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶2.1 Å晶体

3 讨论

目前已发表的α-芋螺毒素与AChBPs共结晶结构采用的结晶条件都有所不同，PnIA（A10L D14K）采用的结晶条件是：17%-18%（W/V）PEG 3350，170-200 mmol/L Na2SO4，100 mmol/L Bis-Tris propane，pH7.5［5］；TxIA（A10L）采用的结晶条件是：20% polyethyleneglycol 3350 and bistrispropane at pH8.5［8］；ImI在两个条件都得到晶体，它们分别是：11%-14% PEG-4000，0.1 mol/L Tris，pH7.5［6］和100 mmol/L sodium acetate（pH5.5）and polyethylene glycol 5000 monomethylether［7］；我们也在两个条件下得到GIC的共结晶，分别是：1.5 mol/L lithium sulfate monohydrate，0.1 mol/L Tris，pH8.5［9］和0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。以上看出，不同的α-芋螺毒素与AChBPs共结晶其结晶条件不同，同一α-芋螺毒素得到高分辨率的结晶条件也可以是多个。结晶条件千变万化，这可能与结晶的方法及蛋白的性质、纯度、缓冲液等因素有关。

本实验采用的结晶方法是液-液扩散法（Liquidliquid diffusion），其原理如图6所示，当把沉淀剂滴加到蛋白质溶液表面，它通过与蛋白质溶液接触面扩散到蛋白质溶液中，沉淀剂从蛋白质溶液中吸走水分，从而使蛋白质溶液浓度不断增大。因此在两溶液接触面形成浓度梯度，随着沉淀剂扩散进入的量越多，蛋白质溶液浓度就越大。蛋白质由不饱和溶液变成饱和溶液，再变成过饱和溶液，从而开始结晶［10］。

图6 液-液扩散法结晶原理

我 们 利 用LtIA、TxIB、LvIA、TxID、RegIA、GIC 等多种α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶［9，17-20］，在以上条件下有LtIA、LvIA和GIC得到共结晶晶体。优化后GIC分辨率较高，LtIA和LvIA共结晶晶体的优化条件待进一步探讨。不同的α-芋螺毒素对Ac-AChBP结晶影响，需要不同的结晶条件才能得到分辨率高的晶体。另外，每种α-芋螺毒素的溶解度不同，它们的溶解度对共结晶也有影响。

共结晶前采用浓度较稀的Ac-AChBP 蛋白液与浓度较稀的α-芋螺毒素溶液先共混好，这种方法可以使α-芋螺毒素更好溶解，因为它们先混合在较稀的溶液中，结合后还要经过凝胶色谱纯化，所以这种方法不仅使Ac-AchBP和α-芋螺毒素充分溶解和结合，还可以除去α-芋螺毒素冻干粉中的杂质对结晶的影响。

我们试用另外一种共结晶方法，即把得到的Ac-AChBP晶体浸泡在α-芋螺毒素溶液中，浸泡时间为两周，观察α-芋螺毒素能否结合到晶体内部。但晶体送往上海同步光源收集数据后，分析结果显示α-芋螺毒素没有结合上Ac-AChBP，这说明α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶的方法最好还是Ac-AChBP与α-芋螺毒素溶液先混合好再结晶，这样它们才容易结合并共结晶。

我们先研究Ac-AChBP蛋白的结晶条件，然后在此基础上再研究共结晶条件，可以避免浪费α-芋螺毒素，而且还可以分析每种α-芋螺毒素对共结晶条件的影响。

4 结论

本研究表达与纯化海兔乙酰胆碱结合蛋白（Ac-AChBP），并把它与α-芋螺毒素GIC共结晶，采用正交实验，并利用结晶机器人及HAMPTON RESEARCH试剂盒对其结晶条件进行筛选与优化，在0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的条件下生长出较好质量的晶体，其分辨率达到2.1 Å。

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（责任编辑 马鑫）

Screening and Optimization of Co-crystallization Condition of α-Conotoxin GIC Complex with Ac-AchBP

LIN Bo LIU Kun ZHU Ming-yue LI Wei DONG Xu LI Meng-sen
（Hainan Provincial Key Laboratory of Carcinogenesis and Intervention，Hainan Medical College，Haikou 571199）

The aim is to screen and optimize the co-crystallization condition of α-conotoxin complex with acetylcholine binding protein（AChBPs），and to obtain co-crystals with high resolution. AChBP from Aplysia californica（Ac-AChBP）was expressed in insect expression system and purified by gel filtration chromatography. Then，the purified Ac-AChBP was co-crystalized with α-conotoxin GIC，further，the HAMPTON RESEARCH crystal kit and the crystal robot were applied screening and optimization of the growth condition of crystallization. Results showed that crystal grew well under the growth condition of 0.6 mol/L ammonium citrate dibasic and pH4.8 of 0.1 mol/L sodium acetate trihydrate，and the resolution of the crystal reached 2.1 Å. In conclusion，the co-crystal of α-conotoxin GIC complex with Ac-AChBP with a high resolution may be acquired via screening and optimization of crystallization condition（The molar concentration of ammonium citrate dibasic and the pH of 0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate）.

α-conotoxin GIC；acetylcholine-binding proteins；co-crystallization；optimization of crystal condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.028

2016-06-02

国家自然科学基金项目（31560243，81560450），海南医学院科研培育基金项目（HY2013-05）

林波，男，助理研究员，研究方向：蛋白质结构；E-mail：linbo_752@163.com

李孟森，男，研究员，研究方向：肝癌耐药；E-mail：mengsenli@163.com