肠道菌群代谢产物IAID对特应性皮炎小鼠模型的作用

于金蕾 朱振来 张月强 张 晨 李 巍

·论著·

肠道菌群代谢产物IAID对特应性皮炎小鼠模型的作用

于金蕾 朱振来 张月强 张 晨 李 巍

目的： 确定肠道菌群代谢产物吲哚-3-甲醛(IAID，indole-3-carboxaldehyde)在特应性皮炎(AD)小鼠模型中的作用。方法： 将C57小鼠随机分为对照组、模型组和IAID组。小鼠双耳外涂卡泊三醇(MC903)制备AD模型，IAID组给予65 μg/kg IAID灌胃，模型组灌等体积DMSO作为对照，对照组不处理。10天后肉眼观察大体炎症情况，千分尺测量小鼠耳廓厚度，ELISA法检测小鼠血清中总IgE水平并通过RT-PCR的方法检测全皮中IL4，IL5，IL6，IL13，IL33，TSLP的表达。结果： IAID组小鼠与模型组相比大体炎症明显减轻，血清总IgE水平明显降低(P<0.001)，皮损IL13、TSLP的mRNA水平也显著下降(P<0.05)。结论： 肠道菌群代谢产物IAID可以缓解AD小鼠模型的皮肤炎症。

特应性皮炎； 吲哚-3-甲醛； 肠道菌群

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其发病机制受诸多因素的调控[1]。研究发现肠道菌群的代谢与过敏性疾病密切相关，色氨酸为肠道菌群提供所需氮源，IAID是色氨酸的一种重要的吲哚类代谢产物,在过敏性疾病中,肠道菌群代谢色氨酸障碍，导致包括AD在内的过敏性疾病患者血液中色氨酸的浓度增高，而色氨酸代谢被抑制[2]。然而，IAID作为肠道菌群的一种重要代谢产物在AD的发生发展中扮演什么样的角色并不清楚。本研究利用AD小鼠模型，研究肠道菌群代谢产物IAID对AD皮肤炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用动物全部为C57小鼠，来自第四军医大学动物中心，所有小鼠均为SPF级别，并在第四军医大学实验动物中心进行SPF级别环境饲养，小鼠饲料均为SPF级别。

1.2 主要试剂与药物 二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司出品，吲哚-3-甲醛(IAID)来自日本TCI公司，Trizol和SuperScript II反转录试剂盒为日本Takara公司产品，Taq PCR Master Mix北京天为时代科技技术有限公司产品。Elisa试剂盒来自上海星科生物有限公司。

1.3 AD动物模型建立 将15只8周龄雌性C57小鼠随机分为三组：对照组，模型组，IAID组，每天于模型组和IAID组小鼠双耳处均匀涂抹2 nm MC903连续涂抹10天进行造模[3]，并于实验前2天起通过灌胃的方式将IAID(65 μg/kg溶于10%的DMSO中)注入IAID组小鼠食道内，模型组灌注同体积的10% DMSO溶液，对照组不做任何处理。

1.4 大体观察及组织样本处理 于实验第10天用千分尺测量小鼠耳厚，并拍照存档；小鼠眼球采血，吸取上清存于-20℃用于ELISA检测IgE水平；然后处死小鼠，剪下小鼠耳朵，小鼠耳部皮肤取0.2 cm宽1 cm长进行福尔马林固定，制作石蜡切片，用作HE和肥大细胞染色；其余耳部组织存于-80°，用于RNA的提取。

1.5 HE染色 标本先用4%甲醛浸泡24 h，自动脱水机脱水后进行透明处理，浸蜡5 h后用石蜡包埋，4 μm 连续切片60℃烘烤30 min后进行染色。

1.6 RT-PCR检测细胞因子的表达 采用Trizol法提取总RNA，严格按照试剂盒说明书操作，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。IL33上游引物5’-CTTCTCTGCCTATCCACGGG-3’；下游引物5’-CTCAGGGAGGCAGGAGACT-3’；HPRT上游引物5’-AATTATGGACAGGACTGAACGTCTTGCT-3’；下游引物5’-TCCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAGC-3’；IL4上游引物5’-CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG-3’；下游引物5’-CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG-3’；IL5上游引物5’-GACCTTGACACAGCTGTCCG-3’；下游引物5’-ATTTCCACAGTACCCCCACG-3’；TSLP上游引物5’-CCCCGACAAAACATTTGCCC-3’；下游引物5’-TGCCATTTCCTGAGTACCGTC-3’；IL13上游引物5’-GCCAAGATCTGTGTCTCTCCC-3’；下游引物5’-CACTCCATACCATGCTGCCG-3’。

1.7 ELISA检测血清总IgE 小鼠眼球采血，静置2 h左右，离心1200 r/min，5 min后吸取上清严格按照试剂盒提供的步骤操作。

1.8 统计学方法 用Graphpad Prism 5统计软件进行分析。组间比较用Mann-Whitney T检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IAID可以减轻大体炎症 造模10天后，与模型组小鼠相比，IAID组耳廓红肿明显减轻，鳞屑明显减少(图1a～c)。千分尺测得IAID组的耳厚(391.88±52.42 μm)比模型组(608±120.88 μm)明显变薄(图1g),HE染色也证实表皮和真皮厚度薄于模型组。另外，真皮中浸润的炎细胞也有明显减少(图1d～f)。以上结果证明，IAID可以抑制炎细胞的浸润，减轻炎症引起的耳部红肿。

2.2 IAID可以抑制Th2型细胞因子的分泌 由于AD是一个Th2型为主的免疫反应，在MC903诱导的小鼠模型中，皮肤中的Th2细胞因子升高；另外，越来越多的观点认为，TSLP是启动AD发病机制的关键分子。因此，我们通过RT-PCR的方法检测小鼠耳部组织中IL4、IL5、IL6、IL13、IL33、TSLP的水平，结果发现IAID组的IL4、IL5、IL6、IL33的水平与AD模型组没有明显差别(图2a、b、c、e)，但IL13、TSLP的mRNA水平比MC903组明显降低(图2d、f),且以TSLP降低的程度更为明显。综合以上结果，我们认为IAID可能主要是通过抑制TSLP的表达进而抑制MC903诱导的炎症。

2.3 IAID组总IgE水平降低 众所周知，Th2型细胞可以通过其产生的炎症因子，促进B细胞的类别转换，促进IgE的产生。因而我们通过ELISA的方法，检测了小鼠外周血中总IgE的水平。我们发现，与MC903组相比，IAID组外周血中的总IgE水平有明显下降(P<0.001)(图3)。该结果说明，IAID可以通过抑制IgE的产生，抑制炎症的进展。

3 讨论

MC903模型是研究AD炎症的一种很稳定的模型，其关键环节是MC903促进角质形成细胞分泌TSLP，TSLP与免疫细胞上的受体结合，激活免疫细胞，引起了大体的炎症表现：皮肤红肿、结痂、瘙痒，真皮中炎细胞浸润增多，Th2型细胞因子水平升高，血中总IgE水平的升高等一系列系统症状[3]。本研究基于本模型探讨了色氨酸代谢产物IAID在AD炎症中的作用，结合以上数据并基于文献分析，我们认为IAID可能通过激活了肠道的免疫细胞，后者迁移到皮肤表面，与角质形成细胞相互作用，抑制了TSLP的产生，其被抑制后刺激T细胞分泌细胞因子的能力减弱，因而导致Th2型细胞因子分泌减少，抑制AD的炎症，但确切机制有待进一步探究。

肠道菌群的重要性被越来越多的人所认识，其代谢产物被认为是人体生理功能的重要调节分子[4]。研究发现肠道菌群的代谢不仅与肠道疾病相关，与肥胖、肿瘤、衰老、风湿性关节炎的关系也非常密切[5-7]。在此背景下，肠道菌群与皮肤疾病的相关研究也逐渐引起人们的重视,研究发现婴儿湿疹的患者肠道菌群的多样性减少[8]，肠道菌群通过调节Th17型的免疫应答，参与咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的发生[9]，然而肠道菌群代谢在AD中发挥的作用尚无报导。

图1 a～c:依次为对照组、模型红、IAID组，c较d红肿减轻，鳞屑明显减少；d～f：依次为对照组、模型红、IAID组真皮内浸润的炎细胞也明显减少(HE,×200)；g:千分尺测量小鼠耳廓厚度，IAID组的耳厚比模型组薄(n=5,*P<0.05)；h、i：HE染色后镜下测得，IAID组表皮以及真皮厚度比模型组薄(n=5,*P<0.05)

图2 a～f，依次是IL4,IL5,IL6,IL13,IL33,TSLP的mRNA水平(n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

图3 小鼠血清总IgE水平(n=5,***P<0.001)

肠道菌群代谢所需氮源主要来源于色氨酸，后者是一种必需氨基酸，广泛存在于高蛋白质食物(蛋类、鱼类、肉、奶酪等)之中，人体在摄入上述食物后，肠道菌群会将色氨酸分解而产生各种吲哚类代谢产物，例如吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酸、吲哚-3-甲醛(IAID)等[10]。研究发现这些代谢产物在介导菌群与宿主的免疫应答中发挥了重要作用[11]，在脑脊髓炎模型中色氨酸的代谢产物减少，通过外源添加色氨酸代谢产物IAID后，炎症相关评分会降低[12]。另一研究发现肠道乳酸杆菌代谢色氨酸产生IAID，后者通过激活芳香烃受体参与黏膜免疫的调节。然而，IAID是否也参与对AD的调节尚不明确。

本研究发现肠道菌群的代谢产物IAID可以缓解MC903诱导的AD样炎症，为揭示肠道菌群与AD的关系、研究调控AD的新策略进行了积极的探索。

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(收稿：2016-08-30 修回：2016-09-26)

The impact of gut microbial metabolite on mouse model of atopic dermatitis

YUJinlei,ZHUZhenlai,ZHANGYueqiang,ZHANGChen,LIWei.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIWei,E-mail:liweiderma@163.com

Objective: To determine the impact of gut microbial metabolite indole-3-carboxaldehyde (IAID) on mouse model of atopic dermatitis (AD). Methods: C57 mice were divided into 3 groups: control group, model group and IAID group. Vitamin D3 analog MC903 was applied on on mice ear to establish an AD-like model. The mice in IAID group were gavaged with 65 μg/kg IAID, and the same amount of DMSO as a vehicle control through administration by gavaging. At day 10, The mice ears were observed for any inflammatory sign and the thickness of the ears were measured. The RT-PCR technique was used to detect the expression of IL4, IL5, IL6, IL13, IL33, TSLP in whole skin and ELISA technique was used to detect the level of total IgE. Results: Compared to model group, we observed a obvious alleviation in IAID group with a decreased level of total IgE (P<0.001) and IL13, TSLP (P<0.05). Conclusion: Gut microbial metabolite IAID can relieve the severity of AD-like inflammation in the mice model.

atopic dermatitis; indole-3-carboxaldehyde (IAID ); gut microbial flora

第四军医大学西京皮肤医院，陕西西安，710032

李巍，E-mail: liweiderma@163.com