启动子研究进展

李法君

(山东省潍坊科技学院 262700)

启动子(promoter)是一段位于结构基因5′端上游，提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，长度因生物种类而异， 一般不超过200 bp。它是典型的顺式作用元件，与转录因子(反式作用因子)相结合调控基因表达的水平、部位及方式。本文介绍了启动子的相关知识，以便于全面清晰地认识启动子。

1 启动子的结构

1.1 原核生物的启动子 一般长度为20～200 bp，通常由4部分组成[1]：①转录起始序列CAT：为转录起始位点；②pribnow box(-10区)：其共有序列为TATAAT，是 RNA 聚合酶的结合位点；③sextama box(-35区)：其共有序列是 TTGACA，是 RNA 聚合酶的识别位点；④间隔区：为pribnow box与sextama box之间的区域，当两者的中心位置相距16～18 bp时，该启动子的转录功能较强，而当两者的中心位置之间的距离比这更近或更远时，起始转录的功能均会减弱。

1.2 真核生物的启动子 根据真核基因编码的产物和RNA 聚合酶的种类，可把真核生物的启动子分为三类：rRNA基因启动子(Ⅰ型)、mRNA 基因启动子(Ⅱ型)和 tRNA 基因启动子(Ⅲ型)。 Ⅰ型启动子和Ⅲ型启动子结构简单。Ⅱ型启动子相对复杂，包括4个主要部位[2]：①转录起始位点：其碱基大多为A；②TATA box：为真核生物启动子的核心元件，其共有序列为TATA(A/T)A(A/T)，由富含AT的7个核苷酸构成，它的功能与原核启动子pribnow box相似，能决定 RNA 聚合酶Ⅱ的位置，控制转录起始的准确性及效率；③CAAT box：其共有序列为GGNCAATCT，为RNA聚合酶Ⅱ的一个结合点，控制转录起始的频率；④增强子序列：能提高转录的速率。

2 启动子的分类

依据转录模式的不同，启动子可分为：①组成型启动子：在该类型启动子控制下，结构基因的转录大致恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，如花椰菜花叶病毒的启动子；②组织特异启动子：又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性，如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因的启动子；③诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子和真菌诱导表达基因启动子等。

3 启动子功能的研究方法

3.1 生物信息学预测 启动子作为调控基因转录的重要元件，目前主要是通过生物信息学对其结构特征、转录结合位点及其结合因子进行预测。常用的预测软件包括[3]FirstEF(人的启动子预测)、BDGP(果蝇的启动子预测)、BIMAS(真核生物的启动子预测)、CONSITE(转录因子结合位点预测)、TRES(转录调控因子分析)、TESS(转录因子结合位点预测)、TRRD(真核生物转录调控区域分析)、Gene-Regulation(真核生物转录因子结合位点预测)和TRANSFAC(真核生物转录因子结合位点预测)等。笔者曾借助Gene-Regulation软件分析了日本沼虾胰岛素样促雄性腺激素基因的启动子序列，包括转录起始位点和可能的转录因子结合位点等[4]。

3.2 酵母单杂交实验 酵母单杂交技术的基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域和转录激活结构域组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL 4蛋白是一种典型的转录因子，GAL 4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点。GAL 4的转录激活结构域可与RNA聚合酶相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，GAL 4的DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。基于此，可将GAL 4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。例如，Rishmawi等[5]在拟南芥中通过酵母单杂交实验证实WRKY75 蛋白可与 CAPRICE 基因的启动子序列结合，调控后者的表达。

3.3 染色质免疫共沉淀(ChIP)分析 ChIP也称结合位点分析法，其原理是在生理条件下将细胞内的蛋白质与DNA交联，并在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，之后再用超声波将所得的复合物随机切割成不同长度的染色质片段并沉淀之，最后富集、纯化及其鉴定特异性目的蛋白结合的DNA片段，从而获得蛋白质和DNA相互作用的信息。由ChIP衍生的染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)技术和与第二代测序技术相结合的ChIP-seq 技术是目前在启动子研究领域应用最广泛的两种技术。Lei等[6]在模式生物线虫中同时运用ChIP-chip和ChIP-seq技术证实，HLH-1蛋白可以与多个基因的启动子序列的E-box区域结合。

3.4 瞬时转染法 该方法的原理是通过一定的转染程序将含启动子序列(调控区)的质粒导入培养细胞。在正常情况下，调控区会调控“报告基因”的表达。报告基因是一类在mRNA和蛋白质分子中均容易被检测的基因。含“报告基因”的质粒在培养细胞中转录后，可在特定时刻测定其生产的mRNA或相应的蛋白质来评价调控区的活性。所以，瞬时转染法通常用来测定启动子转录活性的高低。Zi等[7]将猪FUT1基因的5′侧翼序列构建到含p-GL3 启动子的报告基因载体中，进而瞬时转染 HEK293 细胞，结果显示启动子序列的1150～849 bp部分是FUT1 基因的重要调控区。

3.5 凝胶阻滞分析 又称为电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)。其基本原理是：蛋白质与末端标记的核酸探针结合后所形成的复合物的电泳迁移速度比无蛋白结合的核酸探针要慢。该方法可以检测核酸(DNA或RNA)与结合蛋白的相互作用，已经被用于鉴定启动子的结合蛋白。Seluk等[8]用 EMSA方法证明转录因子Elk1 能够结合到KATNB1基因启动子上，促进其转录。

4 启动子的甲基化与多态性

4.1 启动子的甲基化 DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，多见于基因启动子序列的CpG岛。启动子甲基化调节基因表达的机制可能是启动子甲基化的区域能够与DNA 结合蛋白相互结合，通过改变染色质的构象或者占据转录因子的结合位点而阻断转录因子与顺式元件的结合，从而抑制转录的发生。FHIT基因是重要的肿瘤抑制基因。研究表明肺癌中FHIT基因启动子序列甲基化率明显高于正常肺组织，提示甲基化抑制FHIT基因的表达可能是肺癌发生的原因之一[9]。

4.2 启动子的多态性 启动子的多态性主要是指在基因组DNA水平上由于单个核苷酸的变异所引起的启动子序列多态性。启动子多态性调控基因表达的原理可能是：单个核苷酸的变异引起转录因子结合位点的改变，进而影响基因的表达，并最终影响生物体的性状。研究表明，务川黑牛STAT3基因启动子区存在多个单核苷酸多态性位点；相关性分析表明，A-322G位点对务川黑牛体重有极显著影响，其中AG基因型的个体表现为更出色的体重性状[10]。

5 展望

基因的表达调控是多因素、多层次综合作用的结果，启动子作为转录调控中心一直是研究的热点，虽然相关研究已经取得众多研究成果。但是也应认识到，现有实验手段和方法的局限性以及不同物种启动子的复杂性，使得人们还不能十分清晰地了解启动子。相信随着新的分子生物学技术的出现，启动子的功能必然会得到全面的揭示。

(基金项目：山东省高等学校科技计划项目,No. J16LE59；山东省自然科学基金面上项目，No.2016ZRCM12)