高效液相色谱-荧光检测法测定淀粉制品中孔雀石绿隐形孔雀石绿残留量的研究

范芳芳，樊 成，石旭东，伊 昕

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

高效液相色谱-荧光检测法测定淀粉制品中孔雀石绿隐形孔雀石绿残留量的研究

范芳芳，樊 成，石旭东，伊 昕

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

采用高效液相色谱-荧光检测的方法检测粉条等淀粉制品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的残留量；通过乙腈提取、氮吹浓缩、酸性氧化铝小柱净化的方法分离出淀粉制品中的目标物；通过C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（柱后接25%的二氧化铅氧化柱），以乙腈与0.1 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（用冰乙酸调节pH值至4.5）体积比80∶20为缓冲液，实现孔雀石绿和隐形孔雀石绿的分离。于波长588 nm和618 nm处测定2种物质的质量浓度在0.3～8.0 μg/mL线性关系良好，相对偏差（n=7）小于2.5%，检出限为0.08 μg/mL，分析时间为20 min。以粉条为基体进行回收试验，回收率为77.9%～89.5%。

高效液相色谱-荧光检测；孔雀石绿；隐形孔雀石绿；淀粉制品

孔雀石绿（C23H25N2，Malachite green，MG） 是一类合成的三苯基甲烷类化学物质[1-2]，常作为防腐剂、杀菌剂、驱虫剂在水产中使用[3]，用来预防和治疗各类水产动物的水霉病、锶霉病和小瓜虫病等[4]。孔雀石绿及其代谢物（Leucomalachite green，LMG）具有极强的毒性，其官能团三苯甲基可引起肝癌，因此被国际癌症研究机构列为第2类致癌物质[5]。由于孔雀石绿的廉价性，其使用范围又被扩大。近年来，有不良商贩为了使粉条看起来颜色鲜绿，增加卖点，将孔雀石绿作为染色剂在制作粉条等淀粉制品的过程中加入。2015年，曾有地方食药局查获这样一批粉条，加之在一定条件下，孔雀石绿和隐形孔雀石绿会互相转化，因此建立粉条等淀粉制品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿残留的提取及检测方法迫在眉睫。

目前，国内外关于水产品中孔雀石绿及其代谢物提取检测方法的研究[6-11]很多，但对于淀粉制品中MG和LMG的提取检测尚未见报道。水产动物属于生物体，在对MG和LMG残留的提取上存在穿透细胞、去除蛋白[2]等杂质的技术难点，而淀粉制品不存在这些问题。经过查阅大量参考文献及反复的试验，研究最终通过用乙腈反复提取、氮吹至近干、乙腈重新溶解后过酸性氧化铝小柱净化，最后收集全部流出液，再用氮吹仪吹至近干，用乙腈溶解残渣并定容，通过C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm） （柱后接25%的二氧化铅氧化柱），以乙腈与0.1 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH值为4.5）体积比80∶20为缓冲液，实现孔雀石绿和隐形孔雀石绿的分离。该法具有操作简单、定量性好、回收率稳定等特点。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

孔雀石绿（草酸盐）标准品和隐形孔雀石绿标准品，均为德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，其纯度分别为95%和98%，生产批号分别为20201和30103；乙腈，色谱纯，德国默克公司提供；试验用水为超纯水，所用试剂除指定外均为分析纯。

孔雀石绿标准储备液（100 μg/mL），准确称取0.01 g孔雀石绿（草酸盐）标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；隐形孔雀石绿标准储备液（100 μg/mL），准确称取0.01 g隐形孔雀石绿的标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；量取约5.0 g不含孔雀石绿和隐形孔雀石绿的粉条粉碎样于50 mL容量瓶中，量取一定量乙腈进行混匀，经超声、离心后取上清液得到基质溶液。用储备液和基质溶液配置一系列质量浓度的标准工作溶液，于4℃的冰箱中冷藏保存；配制0.1 mol/L的乙酸胺溶液，并用冰乙酸调节pH值为4.5，供流动相用。

1.2 仪器与设备

2998 TDQ型高效液相色谱仪配有二联泵、柱温箱、UV2487型检测器、Waters色谱工作站，美国Waters产品；HP5016SY型氮吹仪，上海济成仪器厂产品；TG16-NS型离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；KQ-250DE型超声仪，昆山市超声仪器有限公司产品；JA1003N型天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），柱后接25%的二氧化铅氧化柱；柱温25℃；流速1.0 mL/min；流动相：乙腈与0.1 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH值为4.5）体积比为80∶20；进样量20 μL；检测波长588 mm和618 mm。

1.4 试验方法

1.4.1 样品提取

取一定量的粉条样品，用打磨机将其打磨至粉末状。称取5.00 g粉条磨碎样于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，剧烈振摇30 s，以转速4 500 r/min离心10 min，取上清液于洁净试管中；然后向50 mL离心管中加入15 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层至试管中。

1.4.2 样品净化

将盛有提取液试管放置含有水浴锅的氮吹仪上，在45℃的条件下氮吹至近干，加入2.5 mL乙腈溶解残渣。将酸性氧化铝小柱放置在固相萃取装置上，用5 mL乙腈活化，将试管中的溶液转移至小柱中，用2.5 mL乙腈洗涤试管2次，洗涤液依次过柱，并控制流速，使其缓缓流下，收集全部流出液，于45℃条件下氮吹至近干，残渣用1 mL乙腈溶解，过0.45 μm滤膜，按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 标准色谱图

通过比较Agilent的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）与Waters-ODS的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）分离情况发现，后者对目标物的分离效果好、基线平稳、杂峰干扰少。在波长分别为588 nm和618 nm时，孔雀石绿和隐形孔雀石绿分别在5.053 min和17.149 min时响应值最大。

5 μg/mL混合标准色谱见图1。

图1 5 μg/mL混合标准色谱

2.2 流动相的选择

试验中色谱分离的难点是孔雀石绿与周围杂质峰的分离程度。通过研究流动相的组成以及各种梯度的淋洗发现，乙腈与0.1 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH值为4.5）体积比为80∶20时，可实现孔雀石绿和隐性孔雀石绿与其周围杂质峰的完全分离，且分离所需时间最短，为20 min。

流动相组成对目标物峰型的影响见表1。

表1 流动相组成对目标物峰型的影响

2.3 线性关系和检出限

在色谱条件下，分别对所配置的孔雀石绿和隐形孔雀石绿的系列混合标准溶液进行测定。以峰面积A对质量浓度C（μg/mL）进行线性回归。

线性回归方程和线性范围见表2。

表2 线性回归方程和线性范围

孔雀石绿和隐形孔雀石绿检出限均为0.08 μg/mL。

2.4 精密度试验

在色谱条件下，用5.0 μg/mL孔雀石绿、隐形孔雀石绿混合标准溶液进样，每次20 μL，重复进样6次，得孔雀石绿和隐形孔雀石绿的相对标准偏差分别为0.8%和1.3%，均小于2.5%。

2.5 回收率

以不含孔雀石绿和隐形孔雀石绿的粉条为样品，采用标准加入法进行回收试验。

回收试验结果（n=7）见表3。

表3 回收试验结果（n=7）

由表3可知，孔雀石绿的回收率整体高于隐形孔雀石绿，但是对于同种目标物质，回收试验时其加入的质量与回收率并无直接关系。

2.6 样品分析

分别从市场购买多批粉条、粉丝以及粉带等淀粉制品，按上述方法在色谱条件下进行测定，并用外标法定量。结果表明，这些产品的残留量均小于0.08 μg/mL。

3 结论与展望

通过研究淀粉制品中MG和LMG残留的检测方法，建立了以乙腈溶解、氮吹浓缩以及酸性氧化铝

小柱净化的提取方法，并用高效液相色谱-荧光检测器的方法进行测定。该法具有稳定性好、重现度高、定量性好以及检出限低等优点。在今后的试验中，应进一步对试验中各个因素进行研究，并且提高回收率。

[1]李宁.孔雀石绿对健康的影响 [J].国外医学（卫生学分册），2005，32（5）：262-264.

[2]翟毓秀，郭莹莹，耿霞，等.孔雀石绿的代谢机理及生物毒性研究进展 [J].中国海洋大学学报（自然科学版），2007，37（1）：27-32.

[3]Gouvello R L，Pobel T，Richards R H，et al.Field efficacy of a 10-day treatment of fumagillin against proliferative kidney disease in rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture，1999，171（1）：27-40.

[4]Fred J Foster，Lowell Woodbury.The use of malachite green as a fish fungicide and antiseptic[J].North American Journal of Aquaculture，1936，3（18）：7-9.

[5]田秀慧，于召强，陈玮，等.超高相液相色谱串联质谱法测定水产苗种中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿[J].食品科学，2013，34（12）：171-177.

[6]龙洲雄，万春花，胡海山，等.高效液相色谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其无色产物的残留量 [J].理化检验（化学分册），2010（4）：368-370.

[7]宫向红，徐英江，任传博，等.HPLC测定水产品中孔雀石绿、亚甲基蓝、结晶紫及其代谢物的残留量 [J].食品科学，2012，33（4）：144-147.

[8]任秀莲，魏琦峰，程春萍，等.高效液相色谱测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的研究进展 [J].中国卫生检验杂志，2007，17（1）：173-176.

[9]Motomizu S，Wakimoto T，Tôei K.Spectrophotometric determination of phosphate in river waters with molybdate and malachite green[J].Analyst，1983，108（1 284）：3 227.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 [S].北京：中国标准出版社，2005.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1479—2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检测方法 [S].北京：中国标准出版社，2004.◇

Study on Extracting Malachite Green and Leucomalachite Green in Starch Products by HPLC-FLD

FAN Fangfang，FAN Cheng，SHI Xudong，YI Xin
（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）coupled with fluorescence detection（FLD）is developed for the detection of malachite green and leucomalachite green from starch products such as vermicelli.The sample is extracted with acetonitrile and purified by nitrogen and passing through SPE column of acidic aliminum oxide.The C18-ODS column 5 μm，4.6 mm×250 mm is used as the stationary phase（link with oxygen column of 25%lead dioxide），and solutions of acetonitrile and 0.1 mol/L ammonium acetate（adjusted to pH 4.5 with glacial acetic acid）mixed by the volume ration of 80∶20 are used as the mobile phase in gradient elution.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the 2 compounds are found in the same range of 0.3～8.0 μg/mL，with their detection limits less than 0.08 μg/mL.Array diode detection at 588 nm and 618 nm is adopted.Values of relative standard deviation（RSD）for the 2 compounds are all less than 2.5%.The time of this method is last for 20 min.Some of starch products are analyzed by this method，and test for recovery is calculated in the range of 77.9%～89.5%.

HPLC-FLD；malachite green；leucomalachite green；starch products

S948

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.021

1671-9646（2017）01a-0074-03

2016-11-11

范芳芳（1987— ），女，硕士，研究方向为食品安全与检测。