基于SSR标记的李种质资源遗传多样性研究

孙 萍,林贤锐,沈建生

(浙江省金华市农业科学研究院,浙江 金华 321000)

基于SSR标记的李种质资源遗传多样性研究

孙 萍,林贤锐,沈建生*

(浙江省金华市农业科学研究院,浙江 金华 321000)

利用13对SSR引物对47份李种质资源进行了遗传多样性分析，结果表明：13对引物在47个样品中的平均等位基因数(Na)为10.846,有效等位基因数(Ne)平均值为4.806,观察杂合度(Ho)平均值为0.746,平均期望杂合度(He)为0.774, Shannon多样性指数(I)平均值为1.817，说明供试的李种质资源具有较高的遗传多样性。基于Nei距离的Neighbor-Joining聚类分析结果表明：47个李样品被分为3个组,同时能够清楚地鉴别出同物异名的种质资源。基于贝叶斯方法的STRUCTURE聚类分析进一步证实了这一结果。表明日本和美国的李品种与我国南方李品种群亲缘关系较近。

李;种质资源； SSR标记;遗传多样性;遗传结构

李是蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(Prunus)植物。在全世界被大多数分类学家所认可的李属植物有30个多种；我国现有8个种、5个变种、800余个品种和类型,这些种由自然状态下的二倍体和六倍体组成。目前商品生产的李常被分为中国李(P.salicina,又称为日本李)[1]和欧洲李(P.domestica)两大类；中国李起源于我国长江流域,多数为二倍体,世界上绝大多数鲜食栽培李品种都是中国李或与中国李有亲缘关系。大多数欧洲李为六倍体[2]。在世界范围内李的栽培种和品种极多,而我国是李的起源地之一,是李种质遗传多样性中心,有着非常丰富的李种质资源[3]。由于李品种丰富以及具有异花授粉特性,种属间(渗透)杂交普遍,中间类型多,种的界限不清楚,再加上长期在不同地区之间的引种,常出现同名异种或同种异名的现象,给种质资源的保存、育种和利用带来极大不便[4]。

在通常情况下,李栽培种或品种的鉴别主要依靠比较植株的叶片、花和果实等形态特征来实现[5-8]。通过表型性状进行种质区分的方法需要大量的田间观察,对表型特征的描述和记录工作强度大,费时费力,能够提供的有效辨识信息却非常有限。李的一些表型性状是由多基因控制的数量性状,容易受到环境因素和植株生长阶段的影响,不能很好地反映真实的遗传背景。另外,李属植物不存在种间杂交障碍,种间杂交产生的基因渐渗会导致不同种或品种表型性状的趋同性[9-10],造成种或品种的混淆。后来发展的同工酶、花粉微观形态以及染色体核型等方法也同样面临诸多问题[11-13]。

SSR标记具有等位基因变异多、信息含量高、多态性高、稳定性好、重复性好、共显性遗传、特异性强、种属间有良好的通用性等优点[14]。因此SSR标记在果树种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评价等方面已成为应用最为广泛的分子标记[15-18]。Dirlewanger等[19]的研究结果表明,苹果、杏、樱桃、桃、李等蔷薇科果树的SSR标记存在明显的共线性。桃等蔷薇科果树中已开发出大量的SSR引物,为李SSR引物的开发提供了十分有用的参考。前人的研究结果[20-21]表明桃的SSR标记可以被成功地转移到李上,这为李SSR标记的选择提供了参考。Horvath等[22]利用SSR标记手段对欧洲李、樱桃李及黑刺李的遗传结构进行了分析,可以很清晰地区分这3个物种,这为不同李子品种的起源研究提供了科学的依据。Carrasco等[23]基于SSR标记对中国李的遗传多样性进行了研究,研究结果对李种质资源的管理和保护有重要的意义。另外Mnejja等[24]利用中国李的基因组文库开发了新的SSR引物,这为李种质资源的遗传分析提供了方便。

笔者在前人研究的基础上,进一步筛选了适合李基因组的SSR标记,并利用筛选的SSR标记对主要李品种(或类型)进行了遗传多样性分析和品种鉴别,旨在为李育种、种质保存与利用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试李材料共47份,于春季采自浙江省金华市农科院试验基地的李品种园,详见表1。采集健康幼嫩叶片分别置于有编号的采集袋内,用变色硅胶迅速干燥,带回实验室,用于DNA的提取。

表1 供试李材料及其来源

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB法[25]从用硅胶干燥的李叶片中提取总DNA,稀释到10～30 ng/μL,储存在-20 ℃。

1.2.2 SSR标记的筛选 随机抽取8个样品DNA模板用56对SSR引物进行扩增,将扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上以60 W恒压电泳约2.5 h,电泳后银染显色，用Bio-RadGelDoc2000凝胶成像仪(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA)拍照记录。从56对SSR引物中筛选出13对扩增条带清晰、稳定的引物，进行SSR扩增,结果详见表2。为了实现微卫星多态性的荧光半自动检测,在试验前必须对筛选好的引物进行荧光修饰,在单向引物的5′端(或3′端)加上荧光修饰基团；荧光引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应体系为：10×PCR buffer (Mg2+) 2 μL、2 mmol/L dNTP 1 μL、0.5 U rTaq聚合酶0.1 μL、浓度为10 μmol/L的正反向引物各0.25 μL、20 mg/L DNA模板1 μL。使用Eppendorf Mastercycler进行DNA扩增。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s,50～60 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min,在4 ℃下保存。对PCR产物用灭菌后的双蒸水稀释100～200倍,在ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳检测,用Gene Mapper 4.0对电泳结果在60～350 bp片段大小范围内进行数据采集。

表2 SSR引物及其扩增的长度范围

1.3 数据分析

将测序结果导入软件Genetic Profile v 1.0(Molecular Dynamics),参照峰值强度及分子内标的大小,确定微卫星位点扩增片段的区间,对片段大小进行统计;对于出现多峰型的样品,重新进行PCR试验后再确定其片段大小;将统计结果保存为EXCEL格式，以备后续分析之用。

利用遗传数据分析软件GenAlEx 6.3[28]计算多态性等位基因数(Na)、SSR位点的有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、固定指数(F)及Shannon多样性指数(I)等遗传多样性指标。

用软件POPULATION 1.2[29]基于Nei的遗传距离对47个李品种进行Neighbor-Joining 聚类分析,并利用软件DENDROSCOPE 3[30]描绘和修改聚类图。

另外用一种贝叶斯聚类方法[31]反映群体的遗传结构并确定最佳的群体分组,这种方法用STRUCTURE version 2.3.3软件完成。首先设定K=1～5,设定Burn-in周期为100000,MCMC的重复次数为100000次,采用混合模型和相关等位基因频率,对不同的K值进行10次重复运行,然后将后缀为“_f”的结果文件压缩,上传到“STRUCTURE HARVESTER”网站(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/),通过deltaK确定最佳K值[32]。

2 结果与分析

2.1 SSR扩增产物的多态性

13对引物在47个样品中的多态性等位基因数(Na)从6～17不等,平均等位基因数为10.846(表3),其中引物UDP98-025扩增出的等位基因数最少(6个),引物CPPCT022扩增出的等位基因数最多(17个)。每个样品每对引物产生1个或2个等位基因,有效等位基因数(Ne)范围为3.130(引物CPPCT026)～7.808(BPPCT038),平均值为4.806。

从表3还可以看出： SSR位点的观察杂合度(Ho)为0.457(CPPCT026)～0.891(UDP98-025),平均值为0.746；期望杂合度(He)为0.681(CPPCT026)～0.872(BPPCT038),平均值为0.774； Shannon多样性指数(I)为1.401(UDP98-025)～2.386(BPPCT038),平均值为1.817。这些结果说明供试李材料的遗传变异程度较高,具有较高的遗传多样性。

2.2 聚类分析

2.2.1 Neighbor-Joining聚类分析 从图1可以得出:47个李地方品种被分为3组,第Ⅰ组包括23个品种,其中品种15表现特殊,独立成为第一亚组,2、3、1、4等9个品种组成第二亚组,其余13个品种视为第三亚组;第Ⅱ组包括14个品种,被分为两个亚组,在第一亚组中包括来自美国、日本的6个品种,第二亚组中包括杏李杂交种在内的8个品种;其余10个品种聚在第Ⅲ组中,主要包括来自中国辽宁、美国等的李品种。在所供试的47个样品中,品种45与46、35与36、38与39，以及27与28的遗传一致度为1；品种13与14、19与20的遗传一致度为0.99；样品5与7的遗传一致度为0.95(数据未列出)。

表3 47个栽培李类型13对引物的遗传参数

图1 基于Nei的遗传距离的Neighbor-Joining聚类分析结果

2.2.2 贝叶斯聚类分析 将47个李地方品种的K值设为1～10，进行贝叶斯遗传分析,运行10次重复后发现最适K值为3(图2)。

使用STRUCTURE软件得到了与Neighbor-Joining聚类分析相似的结果,根据DeltaK确定最佳类群数为K=3。如图3所示,在K=3的情况下,将47个样品分为3组,品种4、1、3、2等9个供试样品以红色为主，视为第一组,与N-J聚类分析结果中的第一组中的第一亚组一致;以绿色为主的12个供试样品组成第二组,与N-J聚类分析结果中的第一组中的第二亚组基本一致;其余的26个样品为第三组。其中部分样品表现为2个或3个基因池的混合。

3 讨论

3.1 遗传多样性分析

等位基因数和杂合度是反映所用SSR位点鉴别植物基因型能力的2个重要指标。13对引物在47个样品中平均等位基因数为10.846,有效等位基因数(Ne)平均值为4.806,观察杂合度(Ho)平均值为0.746,平均期望杂合度(He)为0.774,比Basilio Carrasco等[33]在29个日本李品种中得到的结果(Na=12.1,Ne=5.2,Ho=0.9,He=0.8)低,但显著高于Ahmad、Mnejja等在李资源上的研究结果(Na=4.3[34]；Na=5.7,Ho=0.73[35])。同时本研究中李种质资源的遗传多样性水平明显高于桃[36](Na=6.6～7.3,Ho=0.35,He=0.5～0.55)、扁桃[37](Na=8.8,Ho=0.7,He=0.79)、杏[38](Na=3.5,Ho=0.58)、樱桃[39](Na=3.5～6.0,He=0.49～0.66)等其他李属植物的,说明供试的李种质资源具有较高的遗传多样性水平。这为李种质资源圃的建立奠定了基础。

图2 STRUCTURE分析得出的最适K值

图3 用STRUCTURE计算的K=3时的李样品分组情况

3.2 遗传结构分析

基于Nei距离的Neighbor-Joining聚类分析以及基于贝叶斯方法的STRUCTURE聚类分析,均清楚地检测到李供试样品的遗传结构:47个李样品被分为3个组。其中早美丽、红美丽、井上、加拿大等品种聚在一起,它们在生产上的性状相似,成熟期、单果重较为接近,说明它们的亲缘关系较近;采集于浙江及附近省市的浦江桃形李、芙蓉李、黄心李、红心李、槜李、天目山李、松山李、中山李以及来自日本的秋姬李、美国的安格洛聚在一起,说明日本和美国的李品种与我国南方李品种群亲缘关系较近,进一步证实了日本李是从我国南方引进中国李的种质,并进而传到美国等世界各地,这与刘威生等[41]的研究结果一致。

在种质资源圃的建立过程中鉴定、剔除重复样品,可以节约种质资源保存的土地、资金和时间,从而使种质资源圃管理者集中精力进行特异的、多样的和有价值的种质的鉴定、评价、更新复壮等工作。SSR分析能有效地区分重复收集品、鉴别同名异物和同物异名的种质资源。从Neighbor-Joining聚类图中可以清晰地看到浦江桃形李1和浦江桃形李2、芙蓉李与16号的遗传一致度为1,说明这两对材料是重复收集品;美蓝宝石与皇家宝石这两种材料从植物学形态上看很难区分,遗传一致度为1,说明它们之间存在着同物异名的现象;品种李王与变异李王、松山李与中山李、蜜思李与其芽变品种6-5早熟之间的遗传一致度分别为0.99、0.99、0.95,说明用SSR技术检测李种质资源时对基因组DNA差异的灵敏性较高,因此SSR标记是可以用于李种质资源鉴定、评价的优良标记。另外,根据遗传学获得的资料和证据可以帮助制定合理的管理措施和有效的保护策略。从STRUCTURE分析图中可以看到6-5早熟芽变品种、浦江桃形李、天目山李、松山李、秋姬李、安格洛、桂林李等李品种表现出了3个基因库的混合,应在以后的研究中加以关注和保护。

本研究采用两种方法分析了李种质资源的遗传结构,由于不同的分析方法所提供的信息量不同，导致两种不同的分析方法所得到的结果并不完全一致,例如在Neighbor-Joining聚类图中品种‘玫瑰’表现出特异性，单独聚成一个亚组,而在贝叶斯聚类分析中这个品种没有表现出特异性。这两种方法各有特点,聚类分析能够量化地体现出品种间的差异,而贝叶斯分析能更直观地揭示品种间的来源差异,因此将这两种方法结合起来进行分析,可以相互验证、相互补充,更能充分地揭示出品种间的遗传关系和遗传多样性。

然而本研究聚类结果不能将国外品种与地方品种(品系)明显分开,大多数的美国李品种和日本李品种与我国南方李品种的亲缘关系较近,初步说明国外的中国李品种可能是从我国南方地区引进,然后选育而来的。因此,今后仍需全面收集国内外李品种,特别是日本、美国和我国南方地区的李品种,结合SSR等分子标记方法进行进一步的研究。

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(责任编辑:黄荣华)

Study on Genetic Diversity of Plum Germplasm Resources Based on SSR Markers

SUN Ping, LIN Xian-rui, SHEN Jian-sheng*

(Jinhua Academy of Agricultural Sciences in Zhejiang Province, Jinhua 321000, China)

Thirteen pairs of SSR (Simple Sequence Repeats) primers were used to evaluate the genetic diversity of 47 accessions of plum germplasm resources. The results showed that the mean number of polymorphic alleles (Na) was 10.846, the number of effective alleles (Ne) per locus was 4.806, the average observed heterozygosity (Ho) was 0.746, the average expected heterozygosity (He) was 0.774, and the mean Shannon’s diversity index (I) was 1.817, suggesting the tested plum germplasm resources had a high genetic diversity. Neighbor-Joining clustering analysis based on Nei’s distance indicated that 47 plum samples were divided into 3 groups, and the synonyms of these germplasm resources could be identified clearly, which was similar to the results of STRUCTURE clustering analysis based on Bayesian method. It was concluded that the plum germplasm resources from Japan and USA had a closer phylogenetic relationship with those from the Southern China.

Plum; Germplasm resource; SSR marker; Genetic diversity; Genetic structure

2016-09-26

浙江省公益技术研究农业项目(2013C32024)。

孙萍(1986─),女,农艺师,硕士,主要从事果树种质资源的遗传多样性研究。*通讯作者：沈建生。

S662.3

A

1001-8581(2017)02-0033-07