美系大白猪LEF-1基因多态性与乳头数及生长性状的相关性研究

*（.华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室，湖北 武汉 40070；.湖北省畜禽育种中心，湖北 武汉 4007；.浙江天蓬集团有限公司，浙江 江山 4）

美系大白猪LEF-1基因多态性与乳头数及生长性状的相关性研究

胡闪耀1，杨 华2，姜佳佳3，毛 翠3，毛慧敏3，王利通3，王国水3，左 波1*
（1.华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室，湖北 武汉 430070；2.湖北省畜禽育种中心，湖北 武汉 430072；3.浙江天蓬集团有限公司，浙江 江山 324111）

乳头数是衡量母猪整体繁殖性能的重要指标之一，增加母猪有效乳头数对于提高仔猪哺乳成活率具有重要意义。该试验采用PCR-RFLP技术，在美系大白（633头）群体中，对LEF-1基因的多态性进行检测和遗传效应分析。研究结果发现，在美系大白猪中检测到LEF-1基因三种基因型（AA、AG和GG基因型）的存在，但不同基因型个体之间乳头数无显著差异。

猪；LEF-1；SNP；关联分析

1 前言

淋巴增强结合因子1（LEF-1）属于调节蛋白家族的一员，是最早被发现参与乳腺形成的调节因子之一。LEF-1是经典Wnt信号通路中的调节因子之一，该信号通路在胚胎发育过程中，可以调节早期的乳腺形态发生变化[1-2]。因此，S.Tetzlaff等将LEF-1作为影响猪乳头数的候选基因，并在其3’端UTR发现了两个SNPs（EU719607：g.1351T＞C，g.1666A＞C）与猪乳头数显著相关[3]；Xu RX等以3个中国地方猪种和大白猪为材料，对LEF-1基因进行重测序，分别在第4外显子和第9内含子上检测到两个新的突变位 点（NC_010450.3：g.99514A＞G，119846C＞T）。关联分析发现，这两个突变位点均可以显著影响猪乳头数[4]。这些研究结果表明，LEF-1基因可作为影响猪乳头数的候选基因进行深入的研究。

2 材料与方法

2.1 实验材料

美系大白猪633头（源自浙江开盛生态农业发展有限公司）。基因组DNA采用血液基因组DNA中量提取试剂盒（离心柱型）提取，于-80 ℃超低温冰箱中保存。

2.2 基因型检测

本实验主要利用PCR-RFLP技术进行基因分型，本研究所用引物根据Xu RX（2014）发表的引物序列合成引物：（F）5′--TGATTCTTGTTACTGCTGATGC--3′，（R）5′-- ACCACCCACCCAATGACA--3′。PCR反应体系为20 µL包含以下成分：Sense primer（10 µM），0.5 µL；Antisense primer（10 µM），0.5 µL；ddH2O，8.0 µL；DNA，1.0 µL；2×Es Taq MasterMix（ 含染 料 ），10.0 µL。 反 应 程 序 为：94 ℃，4 min；34个 循 环（94 ℃，30 s-Tm，40 s-72 ℃，根据片段长度有所不同，1 000 bp按30 s设计）；72 ℃，5 min；25 ℃，1 min。PCR产物利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

酶切反应体系为20 µL，其中 PCR production，10.0 µL；FastDigest EcoRII，1.0 µL；10×FastDigest Green Buffer，2.0 µL； ddH2O，7.0 µL。37 ℃消化30 min，然后利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照保存图片，统计基因型。

2.3 基因效应分析

本实验所采用模型为：Tijkl=µ+Gi+Fj+Sk+Pl+eijklm，Tijkl为 性状表型值，µ为平均值，Gi为基因型效应（包括基因加性效应和显性效应）；Fj、Sk、Pl为固定效应，分别为家系、性别、批次，eijklm为残差效应。采用SAS软件GLM模型自编程序完成，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验。

3 结果与分析

3.1 LEF-1基因的PCR-EcoRIIRFLP多态性检测

LEF-1基因酶切分型的PCR产物长为344 bp，见图1，利用EcoRII内切酶酶切后分别产生189 bp和155 bp的片段，根据酶切后产生的条带类型将三种基因型分别命名为：AA型（189 bp+155 bp），AG型（344 bp+189 bp+155 bp），GG型（344 bp）。1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

3.2 LEF-1基因在大白猪中的基因频率分布及与乳头数和生长性状的关联分析

3.2.1 LEF-1基因在大白猪群体中的基因频率

图1 LEF-1基因PCR电泳结果

图2 LEF-1基因PCR-EcoRII-RFLP酶切分型结果

表1 大白猪LEF-1基因EcoRII-RFLP基因型频率和等位基因频率

表2 LEF-1基因EcoRII多态性与美系大白猪乳头数和生长性状的关联分析

利用PCR-EcoRII-RFLP技术对LEF-1基因多态性进行检测，在美系大白猪中检测到三种基因型，对各基因型频率进行统计，结果如表1所示。

由表1可以看出，在美系大白猪群体中LEF-1基因的AA基因型频率高于AG和GG基因型，A等位基因属于优势等位基因。另外，该基因在美系大白猪中不符合哈迪-温伯格平衡（P＜0.05）。

3.2.2 LEF-1基因多态性与美系大白猪乳头数及生长性状的关联分析

分别对LEF-1基因对美系大白猪乳头数及生长性状的遗传效应进行分析，分析结果见表2。关联分析结果表明，在美系大白猪群体中LEF-1基因对乳头数、初生重、体长等性状都没有显著影响。

4 讨论

本实验对LEF-1基因的SNP（g.99514A＞G）位点在美系大白猪中的多态性进行了检测。在美系大白猪中AA、AG和GG三种基因型均有分布，其中A等位基因频率为0.805，属于优势等位基因，这与Xu RX等人的研究结果一致[4]。关联分析研究结果显示，在美系大白群体中AA基因型个体的乳头数略高于AG型和GG型个体，但没有达到显著水平，这与Xu RX等人的研究结果并不一致[4]，说明LEF-1基因的g.99514A＞G突变位点对美系大白猪的乳头数变异没有影响。由此推测该突变位点可能只是一个连锁性的标记，并不是引起猪乳头数变化的因果突变位点，在不同的群体中对乳头数的遗传效应也不一致。因此，LEF-1基因作为一个影响猪乳头数的候选基因，还需要对其进行进一步的研究，检测是否存在功能性的突变位点，并在不同群体中扩大样本进行分析验证。

[1] VAN GENDEREN C，OKAMURA R M，FARINAS I，et al.Development of several organs that require inductive epithelial-mesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice[J].Genes & development，1994，8(22)：2691-2703.

[2] BORAS-GRANIC K，CHANG H，-GROSSCHEDL R，et al.Lef1 is required for the transition of Wnt signaling from mesenchymal to epithelial cells in the mouse embryonic mammary gland[J].Developmental biology，2006，295(1)：219-231.

[3] TETZLAFF S，JONAS E，PHATSARA C，et al.Evidence for association of lymphoid enhancer-binding factor-1(LEF1) with the number of functional and inverted teats in pigs[J].Cytogenetic and genome research，2009，124(2)：139-146.

[4] XU R X，WEI N，WANG Y，et al.Association of Novel Polymorphisms in Lymphoid Enhancer Binding Factor1(LEF-1) Gene with Number of Teats in Different Breeds of Pig[J].Asian-Australasian journal of animal sciences，2014，27(9)：1254.

2016-12-20）

本项目受国家科技支撑计划（项目编号：2014BAD20B01）、浙江省重大科技专项（项目编号：2014C02010）、中央高校基本科研业务费专项（项目编号：2014PY038；2662016PY012）资助

胡闪耀（1988-），男，河南平顶山人，硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖方面研究，E-mail：shy907530102@qq.com

左波，华中农业大学，动科动医学院教授，E-mail：zuobo@mail.hzau.edu.cn