茶多酚糊剂治疗口腔溃疡动物实验研究

吴枝武 杜昳阳 姚 宇 冯剑颖

茶多酚糊剂治疗口腔溃疡动物实验研究

吴枝武 杜昳阳 姚 宇 冯剑颖

目的 研究茶多酚糊剂对大鼠口腔溃疡愈合的影响及机制。方法30只SD大鼠采用化学灼烧法在大鼠左右颊黏膜建立口腔溃疡模型，左侧溃疡面涂甘油，为甘油对照组，右侧溃疡面涂茶多酚糊剂，为茶多酚糊剂组，每天给药3次，分别于给药的0天、2天、4天、6天、8天各处死6只大鼠。大体观察口腔溃疡黏膜面，测量溃疡面积，免疫组化法检测成纤维细胞因子1（FGF1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在溃疡区的表达。结果（1）茶多酚糊剂组给药4天、6天后溃疡面积较甘油对照组小，差异有统计学意义（P＜0.05）；（2）茶多酚糊剂组4天后炎症细胞浸润较少；（3）给药4天，茶多酚糊剂组与甘油对照组比较，FGF1表达差异无统计学意义（P＞0.05），但α-SMA表达较高，差异有统计学意义[（0.32±0.01）比（0.30±0.01），P＜0.05]；给药6天和8天后，茶多酚糊剂组[FGF1：（0.57±0.02）、（0.66±0.02）；α-SMA：（0.34±0.01）、（0.32±0.02）]较甘油对照组[FGF1：（0.53± 0.02）、（0.43±0.23）；α-SMA：（0.32±0.02）、（0.28±0.03）]FGF1与α-SMA表达均升高，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论茶多酚糊剂在大鼠口腔溃疡的中后期有助于溃疡愈合，其愈合机制可能与抗炎、抗氧化及增高FGF1、α-SMA的表达有关。

大鼠；口腔溃疡；茶多酚糊剂；FGF1；α-SMA

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是最常见的口腔黏膜溃疡类疾病，溃疡灼痛明显患病率高，且具有周期性、复发性、自限性等特征[1-2]。研究[2-4]认为口腔溃疡可能与遗传、免疫、环境、精神生理和微循环障碍等有关。茶多酚（tea polyphenol，TP）是从茶叶中提取的30多种酚类化合物的复合体。大量研究发现茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗氧自由基等作用[5-7]，因其具有抑菌、护齿、防龋的作用也逐步用于口腔保健产品。本文通过茶多酚糊剂应用于大鼠口腔溃疡，探讨茶多酚对口腔溃疡愈合过程的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物 清洁级SD实验大鼠30只，雌性，体质量（190±10）g，实验动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016。实验动物由浙江中医药大学动物实验中心提供，普通饲料饲养。

1.2 主要药品 茶多酚糊剂：AVERTEAX，Star Health and Beauty，LLC，美国（美国佐治亚大学Stephen Hsu教授惠赠）；99%甘油（华东医药股份有限公司）。

1.3 方 法 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，使用口径处理为5mm且管口内塞有棉花的巴氏管吸取饱和氢氧化钠溶液，将巴氏管口贴于大鼠的颊黏膜上，持续时间为60s。大鼠左右侧颊黏膜均做相同处理。建模24h后肉眼观察,大鼠口腔黏膜形成一个直径约5mm的溃疡。溃疡中央凹陷，表面有黄白色假膜覆盖，周围有出血且伴充血水肿。HE染色可见黏膜上皮脱落，固有层有炎症细胞浸润。显示造模成功，见图1（封二）。30只大鼠建模成功，左侧溃疡面涂甘油，为甘油对照组，右侧溃疡面涂茶多酚糊剂，为茶多酚糊剂组，每天给药3次，给药方式为1mL圆头针管推挤0.1mL药剂至溃疡面。分别在给药0、2、4、6、8天随机处死大鼠各6只，完整取下溃疡黏膜及肌层，游标卡尺测量计算溃疡面积。组织块制作石蜡切片，HE染色，免疫组化SP法检测成纤维细胞因子1（FGF1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（FGF1单抗抗体：美国santa cruz公司；α-SMA单抗抗体：丹麦DAKO公司），应用Image-Pro Plus6.0测量平均光密度值半定量蛋白表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用方差分析、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠不同时间口腔溃疡面积比较 建模后，甘油对照组与茶多酚糊剂组大鼠口腔溃疡的面积不断减少。给药0天、2天甘油对照组与茶多酚糊剂组溃疡面积无明显差异，在给药4天、6天后茶多酚糊剂组溃疡面积小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），给药8天两组黏膜均愈合，见图2（封二）。

2.2 两组大鼠口腔黏膜组织病理学观察 给药2天，甘油对照组与茶多酚糊剂组溃疡周围仍可见水肿且表面均覆盖黄白色假膜。镜下观察固有层有大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞为主。给药4天，甘油对照组溃疡表面仍可见部分假膜覆盖，茶多酚糊剂组假膜基本脱落。镜下可见茶多酚糊剂组毛细血管增生明显。给药6天，镜下观察甘油对照组仍有大量炎症细胞浸润，而茶多酚糊剂组上皮修复明显。给药8天后，茶多酚糊剂组溃疡范围不明显，基本愈合。镜下可见两组上皮修复基本完成。

2.3 免疫组化 给药后第6、8天茶多酚糊剂组FGF1表达明显高于甘油对照组（P＜0.05）。给药后第4、6、8天α-SMA的表达明显高于甘油对照组（P＜0.05），给药第6天表达水平最高，第8天表达有所下降。FGF1和α-SMA在黏膜各层均有不同程度表达，其中上皮基底层和固有层表达较多，见图3（封二）、表1～2。

表1 两组口腔溃疡大鼠FGF1表达（平均光密度值，±s）

表1 两组口腔溃疡大鼠FGF1表达（平均光密度值，±s）

注：与甘油对照组相比，*P＜0.05；FGF1：成纤维细胞因子1

组别甘油对照组茶多酚糊剂组只数6 6给药0天0.53±0.02 0.56±0.03给药2天0.60±0.03 0.55±0.02给药4天0.53±0.01 0.54±0.12给药6天0.53±0.02 0.57±0.02*给药8天0.43±0.23 0.66±0.02*

表2 两组口腔溃疡大鼠α-SMA表达（平均光密度值，±s）

表2 两组口腔溃疡大鼠α-SMA表达（平均光密度值，±s）

注：与甘油对照组相比，*P＜0.05；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白

组别甘油对照组茶多酚糊剂组只数6 6给药0天0.29±0.02 0.27±0.02给药2天0.29±0.04 0.26±0.02给药4天0.30±0.01 0.32±0.01*给药6天0.32±0.02 0.34±0.01*给药8天0.28±0.03 0.32±0.02*

3 讨论

研究发现，口腔溃疡的发生发展与氧自由基的增多有关[8]，而茶多酚的结构中富含酚羟基，可提供活泼氢使自由基灭活。Pradip等[7]研究表明，茶多酚可以显著减少损伤组织丙二醇（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性以提高机体自由基清除和抗氧化能力。这可能是茶多酚对口腔溃疡的愈合发挥作用的机制之一。Stephen Hsu等[9-11]研究提示，茶多酚可通过MAPK途径激活Caspase-14以促进损伤皮肤的屏障功能修复，提示茶多酚促进口腔溃疡的愈合与此有关。

本研究表明，茶多酚糊剂的应用可以加速口腔溃疡的愈合过程，尤其是在给药的第4天，茶多酚糊剂组口腔溃疡面积的缩小最为明显,表明茶多酚发挥疗效的主要阶段在溃疡愈合的中后期。茶多酚糊剂给药后，黏膜上皮修复加速，固有层炎症细胞浸润较少。这与茶多酚糊剂抑制炎症反应，促进组织修复再生有关。Relja等[12]研究发现，茶多酚可以通过降低白细胞介素-6（IL-6）、细胞间黏附分子－1和磷酸化IkBα的表达水平发挥抗炎作用。

FGF1是成纤维生长因子家族的成员之一，可诱导成纤维细胞的增殖生长[13-15]。α-SMA是活化的成纤维细胞的蛋白标志物，它表达的增高提示着成纤维细胞的活化增多[16-17]。本实验中茶多酚糊剂给药后，FGF1表达在第6天后显著增加，α-SMA表达在4天后明显增高。表明溃疡愈合的中后期成纤维细胞大量活化增殖，参与溃疡愈合。因此，茶多酚糊剂促进口腔溃疡愈合的机制可能通过促进FGF1的分泌，从而促进成纤维细胞的增殖，进而活化，使得α-SMA表达增高。YaQing Tan等[17]认为FGF1促进组织愈合与其诱导纤维母细胞的增殖分化、促进血管再生以及诱导更多的营养素和氧运送至损伤区域有关。Lee等[18]研究发现Wnt/β-catenin信号通路在组织愈合上发挥重要作用，当β-catenin的表达下降时，会出现α-SMA减少，组织愈合缓慢。因此α-SMA的表达还应该受Wnt/β-catenin信号通路的调节。

目前口腔溃疡的治疗尚无特效方法，临床多用糖皮质激素、抗炎药等。对于ROU频发的患者，应用这些药物治疗可能造成耐药性、菌群失调等不良反应。茶多酚糊剂涂抹治疗口腔溃疡方便，可避免全身用药可能出现的并发症[11]。糊剂在溃疡面与口腔之间起到阻隔的作用，减少口腔分泌物对溃疡的刺激，起到保护作用。相比于喷雾剂和散剂，糊剂作用时间更长，局部吸收效果更佳，有利于溃疡的修复。同时茶多酚结构中的羟基可与细菌蛋白质结合，使蛋白质沉淀而导致细菌死亡，能有效清除口腔中的病菌如牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌等，避免溃疡再次受到病菌的感染而造成更为严重的疾病[19-21]。本研究采用的茶多酚以糊剂为载体，有利于黏膜面的吸收和给药，具有临床推广应用价值，有待进一步研究其溃疡愈合机制及联合用药方式。

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（收稿：2016-06-17 修回：2016-08-10）

Therapeutic Effect of Tea Polyphenol Paste on Oral Ulcer in Rats

WU Zhiwu,DU Yiyang,YAO Yu,FENG Jianying. Department of Orthodontics,College of Oral Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China

Objective To study the therapeutic effect of tea polyphenols paste on oral ulcer in rats and the underlying mechanism.MethodsThirty rats were randomly divided into 5 groups with 6 rats in each group.The oral ulcer animal model was established by chemical burning method on both buccal mucosa of rats.Glycerol control group applied glycerol to the ulcer surface of left buccal mucosa,tea polyphenol paste group applied tea polyphenol paste to the right.The rats were administered 3 times per day.Six rats were sacrificed respectively after the administration on Day 0,Day 2,Day 4,Day 6,and Day 8,then the ulcer area was biopsied and measured,and the healing of ulcer was analyzed by detecting fibroblast growth factor 1（FGF1）and αsmooth muscle actin（α-SMA）levels in the ulcer area with histopathologic and immunohistochemical methods.ResultsThe ulcer area of tea polyphenol paste group on Day 4 and Day 6 was significantly smaller than that of glycerol control group（P＜0.05）.Tea polyphenol paste group had less inflammatory cell infiltration on Day 4 after administration.On Day 4, the expression of FGF1 did not differ between two groups（P＞0.05）,but the level of α-SMA was significantly higher in tea polyphenol paste group than that in control group（0.32±0.01 vs 0.30±0.01,P＜0.05）.On Day 6 and Day 8, the expressions of FGF1 and α-SMA in tea polyphenol paste group（FGF1:0.57+0.02，0.66+0.02;α-SMA:0.34+ 0.01，0.32+0.02）were significantly higher than those in control group and the glycerol control group（FGF1:0.53+ 0.02，0.43+0.23;α-SMA:0.32+0.02，0.28+0.03;all P＜0.05）.ConclusionTea polyphenols paste can contribute to the healing of the oral ulcer at the end of the treatment period.The healing mechanism may be related to anti-inflammation,anti-oxidation and the increased expression of FGF1 and α-SMA.

rats;oral ulcer;tea polyphenol paste;FGF1;α-SMA

国家自然科学基金项目（No.81200802）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（No.2016R410007）

浙江中医药大学口腔医学院正畸科（杭州 310053）

冯剑颖，Tel：13093798116；E-mail：twohorsejy@163.com