华根霉生物酶法合成己酸乙酯条件的研究

刘雪，杨爱华，张学梅，曹建全，孙丽臻

（1.山东景芝酒业股份有限公司，山东景芝262119；2.山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室，山东景芝262119）

华根霉生物酶法合成己酸乙酯条件的研究

刘雪1，2，杨爱华1，张学梅1，曹建全1，2，孙丽臻1，2

（1.山东景芝酒业股份有限公司，山东景芝262119；2.山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室，山东景芝262119）

华根霉发酵可产酯化酶，在一定条件下能够催化己酸与乙醇反应生成己酸乙酯，以合成的己酸乙酯含量为指标对己酸乙酯的酯化合成条件进行单因素实验与正交实验，确定了各因素的最佳水平。通过优化确立了酯化液的反应体系：以老窖泥富集液与无水乙醇按照10∶90的比例配成100m L反应体系，添加3%的己酸，再以100 g/L华根霉麸曲作为粗酶制剂添加入体系中，置于100m L的具塞三角瓶中，25℃下，反应25 d，合成的己酸乙酯可达2302mg/100mL。

酯化酶；己酸；乙醇；己酸乙酯

己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味成分[1-2]，白酒在自然发酵过程中，窖泥中的产酸菌所产生的己酸与酵母所产生的乙醇，在大曲酯化酶的催化作用下可发生化学反应生成己酸乙酯[3-4]。但在自然条件下，通过这个途径产生己酸乙酯非常有限，为了提高己酸乙酯的含量，突出浓香型白酒的风味，不得不寻找其他合成途径，例如化学合成己酸乙酯的研究，李继忠[5]利用对甲苯磺酸催化合成己酸乙酯，产率可达94.44%。张应军等[6]利用固体超强酸SO42-/Fe2O3-CoO催化合成己酸乙酯，其转化率可达97%。在文献中关于酶法合成酯的报道也很多，例如王涛等利用白酒酿造相关酵母发酵产己酸乙酯，己酸乙酯含量提高了3倍[7]。赵磊等利用响应面法优化无溶剂体系酶法合成己酸乙酯，使己酸乙酯含量得到了提高[8]。而通过生物酶法催化合成己酸乙酯在美国联邦法及外文文献中都认为是天然香料，绿色健康，自然感强，对于稳定和提高浓香型白酒的质量具有十分重要的意义[9]。

本研究的主要内容是引进1株酯化酶活力较高的华根霉菌株，将其制成麸曲作为粗酶制剂，用以催化己酸与乙醇发生酯化反应，提高酒体中酯的含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：华根霉F8，中科院成都生物研究所。

老窖泥富集液：己酸菌复合菌液与老窖泥的扩增富集液（富含己酸等）。

麸皮：购买自当地新鲜麸皮。

试剂：己酸、无水乙醇等均为分析纯。

仪器设备：DNP型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；5804R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；气相色谱仪，美国Agilent7820A型气相色谱仪，FID检测器,分流/不分流进样口。

1.2 实验方法

1.2.1 华根霉F8麸曲的培养

1.2.1.1 一级试管培养

制备MES培养基→分装试管→灭菌→摆斜面→接种→培养→一级试管菌种→4℃保存备用。

1.2.1.2 二级试管培养

麸皮+水（1∶0.9）→装试管→制备斜面→灭菌→自一级试管接种→培养至孢子丰富→二级试管菌种→低温保藏。

1.2.1.3 三角瓶培养

麸皮+水（1∶0.9）→装瓶→灭菌→自二级试管接种→每隔12 h扣瓶1次→培养至孢子丰富→取出→30℃烘干备用。

1.2.2 华根霉生物合成己酸乙酯的体系及反应时间的初步确定

取60 m L老窖泥富集液与40 m L无水乙醇配成100m L反应体系，添加2%的己酸，添加5 g华根霉麸曲作为粗酶制剂至体系中，置于100m L的具塞三角瓶中，33℃下，反应35 d，每隔5 d取样测定己酸乙酯合成情况，根据己酸乙酯合成情况初步确立酯化时间。

1.2.3 影响己酸乙酯合成的单因素实验

1.2.3.1 老窖泥富集液与无水乙醇比例对己酸乙酯合成的影响

按一定比例将老窖泥富集液与无水乙醇配成100m L反应体系（二者比例分别为：60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90），添加2%的己酸、5 g粗酶制剂，置于100m L的具塞三角瓶中，分别在33℃酯化温度下反应，反应结束后测定己酸乙酯合成情况，确立老窖泥富集液与无水乙醇的最佳配比。

1.2.3.2 己酸浓度对己酸乙酯合成的影响

按照1.2.3.1优化的最佳配比进行反应体系的配制，分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%的己酸、5 g粗酶制剂，置于100m L的具塞三角瓶中，分别于33℃下反应一定时间，反应结束后测定己酸乙酯合成情况，以确定最适己酸添加比例。

1.2.3.3 华根霉麸曲添加量对己酸乙酯合成的影响

按照1.2.3.1优化的最佳配比进行反应体系的配制，添加最适比例的己酸，分别加入4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g、10 g（干重）粗酶制剂于100m L的具塞三角瓶中，分别于33℃温度下反应一定时间，反应结束后测定己酸乙酯合成情况，以确定最适华根霉麸曲的添加比例。

1.2.3.4 酯化温度对己酸乙酯合成的影响

按照1.2.3.1优化的最佳配比进行反应体系的配制，添加最适比例的己酸和粗酶制剂后，置于100m L的具塞三角瓶中，分别于20℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、37℃下反应一定时间，定时摇瓶混匀，反应结束后测定己酸乙酯合成情况，根据己酸乙酯合成情况确立最佳酯化温度。

1.2.4 正交实验分析

选用正交法，对以上筛选出的最适老窖泥富集液与无水乙醇配比、最佳己酸浓度以及最适华根霉麸曲添加量、最佳酯化温度等单因素进行正交实验设计，选出最佳酯化条件组合。选用4因素3水平L9(34)正交表，因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表L9(34)

1.2.5 气相色谱分析己酸乙酯的含量

色谱柱：DNP 2 m不锈钢填充柱。柱温：柱温105℃。

载气：99.999%高纯氮，氮气：30m L/m in，氢气：30m L/m in，空气：300m L/m in，检测室温度：140℃，进样口温度：140℃，柱流速：18m L/m in，进样量1μL。

2 结果与分析

2.1 酯化时间的确定（图1）

图1 延长酯化时间对己酸乙酯的变化情况

由图1可知，在一定体系下，随着酯化时间的延长，己酸乙酯迅速合成，在反应25 d时达到最高，为108.4mg/100m L。反应25 d后己酸乙酯的合成速度明显变缓慢，在后续进行单因素合成实验中为了减少实验周期，提高效率，选择25 d为最佳酯化时间。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 老窖泥富集液与无水乙醇的配比的确定

按照一定比例调整反应底物的浓度，在33℃条件下酯化25 d后测定己酸乙酯的合成情况，结果见图2，随着无水乙醇含量的提高，己酸乙酯的合成逐渐也在提高，当老窖泥富集液和无水乙醇的比例提高至10∶90时，己酸乙酯含量迅速达到最高值，由此可推测酒精含量越高越有利于己酸乙酯的合成，因此选择老窖泥富集液和无水乙醇的最佳比例为10∶90，此时己酸乙酯产量达505.6mg/100m L。

图2 老窖泥富集液与无水乙醇配比对己酸乙酯合成的影响

2.2.2 己酸浓度的确定

己酸添加量低会影响己酸乙酯的合成，而据报道，酶催化反应为可逆反应，当酸达到一定量时酯化酶会催化酯分解[10]。因此合适的己酸添加量对于稳定己酸乙酯的合成有重要作用。

将老窖泥富集液与无水乙醇按照10∶90的比例配制反应体系，并分别添加不同浓度的己酸，在33℃下反应25 d后测定己酸乙酯的合成情况，结果见图3。由图3可知，随着己酸浓度的提高，己酸乙酯含量也逐渐升高，表明在酯化反应中，作为底物之一的乙醇在含量充足时，适当提高另一关键底物——己酸的含量会促进酯化反应的正向进行，但实际生产中发现己酸含量超过3%时往往会随着蒸馏进入酒体而影响酒体的品质，因此选择3%的己酸浓度作为最终反应浓度。

图3 己酸浓度对己酸乙酯合成的影响

2.2.3 华根霉麸曲添加量的确定

将老窖泥富集液与无水乙醇按照10∶90的比例配制反应体系，添加3%己酸，将华根霉麸曲的添加量进行适当调整，在33℃下反应25 d后测定己酸乙酯的合成情况，结果见图4。由图4可知，随着麸曲添加量的增加，己酸乙酯的合成也逐渐提高。在酯化液的实际生产中也发现增加麸曲的使用量会提高己酸乙酯的合成量，但麸曲使用太多会引起搅拌困难、管道堵塞等问题，因此我们选择华根霉麸曲的添加量最高为100 g/L，此时己酸乙酯的合成量达836.5mg/100m L。

图4 华根霉麸曲添加量对己酸乙酯合成的影响

2.2.4 酯化温度的优化

将老窖泥富集液与无水乙醇按照10∶90的比例配制反应体系，添加3%己酸、100 g/L华根霉麸曲，调整酯化温度，反应25 d后进行己酸乙酯合成情况的分析，结果见图5。

图5 酯化温度对己酸乙酯合成的影响

由图5可知，在一定的反应体系中，随着酯化温度的提高，己酸乙酯的合成逐渐降低，主要是由于高温下酯化酶的活力下降而引起的，但因实际生产中温度受季节变化影响较大，温度低于25℃时不易调控且稳定性差，虽然在25℃下己酸乙酯的合成能力稍低于20℃，但增长幅度相对缓慢，结合实际生产情况我们选择25℃为最适的酯化温度，此时己酸乙酯的合成量为2193.75mg/100m L。

2.3 正交实验结果与分析

通过单因素实验，选取老窖泥富集液与无水乙醇配比、己酸浓度、麸曲添加量、酯化温度4个条件进行4因素3水平正交实验，结果见表2。

通过对表2结果中的极差(R)分析可知，各因素作用的主次顺序为B＞A＞C＞D，即老窖泥富集液与无水乙醇的配比＞酯化温度＞己酸浓度＞麸曲添加量。通过对K值的计算得出华根霉麸曲酯化反应的最优酯化组合为A1B3C3D3，即酯化温度为25℃，老窖泥富集液与无水乙醇的配比为10∶90，己酸添加量为3%，华根霉麸曲添加量为100 g/L，进一步进行验证实验，即老窖泥富集液和无水乙醇以10∶90配制反应体系，添加3%的己酸和100 g/L的华根霉麸曲，在25℃下酯化25 d，测得己酸乙酯含量为2034.5mg/100m L，验证实验结果与正交表中的3号实验结果具有一致性，由此可确定该组合为最优组合。

表2 正交实验结果与分析

3 结果与讨论

本研究的主要内容是引进1株酯化酶活力较高的华根霉菌株，将其制成粗酶制剂，用以催化己酸与乙醇发生酯化反应，提高酒体中酯的含量，通过对其酯化反应条件包括酯化时间、酯化温度、老窖泥富集液与无水乙醇配比、己酸浓度、华根霉麸曲添加量等进行单因素实验优化，确定了酯化反应的最佳条件，通过设计正交实验进一步确定了反应条件的最佳组合，即老窖泥富集液与无水乙醇的配比为10∶90，添加3%的己酸，再加入100 g/L华根霉麸曲作为粗酶制剂添加入体系中，置于100m L的具塞三角瓶中，25℃下，反应25 d，合成的己酸乙酯产量可达2302mg/100m L。

研究中为了缩短实验周期，提高效率，使用的酯化时间为25 d，但实际生产中可根据反应体系中底物浓度适当延长酯化时间，这样既有利于底物反应的充分彻底，又能提高产物的产量。另外实际生产中麸曲的使用会造成搅拌困难和易堵塞管道等情况，若可实现华根霉菌丝体的大量培育，可尝试以粉碎的华根霉菌丝来代替华根霉麸曲作为酯化酶粗酶制剂使用，这也将是今后的研究方向之一。

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Esterification Synthesis of Ethyl Caproateby Using Rhizopus chinensis

LIU Xue1,2,YANG Aihua1,ZHANG Xuemei1,CAO Jianquan1,2and SUN Lizhen1,2
(1.Jingzhi Distillery Co.Ltd.,Jingzhi,Shandong 262119;2.Key Lab of Bio-fermentation Technology,Jingzhi,Shandong 262119,China)

Esterifying enzyme produced by the fermentation of Rhizopus chinensis can catalyze hexanoic acid and ethanol to produce ethyl caproate under certain conditions.The optimum synthesis conditions of ethyl caproate were determined by single factor test and orthogonal test.The best reaction system of esterifying liquid were determined as follows:100m L reaction system was prepared by mixing aged pit mud enrichment liquid with anhydrous ethanol at the ratio of 10∶90,adding 3%hexanoic acid,and adding 100 g/L Rhizopus chinensis starter as the crude enzyme.The reaction system was placed into 100mL flask with a plug,after25 dreaction at25℃,the yield of ethyl caproate reached up to 2302mg/100m L.

esterifying enzyme;hexanoic acid;ethanol;ethyl caproate

TS262.3；TS261.1

A

1001-9286（2017）02-0057-04

10.13746/j.njkj.2016343

2016-11-21；

2016-12-13

刘雪（1986-），女，山东青岛人，工程师，微生物学硕士研究生，山东景芝酒业股份有限公司技术中心分子生物学实验室主任。

曹建全（1965-），男，山东潍坊人，高级工程师，山东景芝酒业股份有限公司技术中心副主任，参与编写《白酒酿造工高级技师培训教程》、《高级酿酒师培训教程》等论著。

优先数字出版时间：2017-01-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170113.1407.001.htm l。