麦粒灸调控IL-17对实验性RA大鼠血清TNF-a、IL-1b含量影响的研究*

高梓珊，甘君学，郭江燕，傅淑平

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023)

实验研究

麦粒灸调控IL-17对实验性RA大鼠血清TNF-a、IL-1b含量影响的研究*

高梓珊，甘君学，郭江燕，傅淑平

(南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023)

目的：探索麦粒灸治疗类风湿性关节炎(RA)抗炎效应的IL-17信号转导机制。方法：雄性SD大鼠66只,随机分为空白组、模型组、空白艾灸组、艾灸组、IL-17过表达模型艾灸组(IL-17过艾组)、IL-17沉默模型艾灸组(IL-17沉艾组)、IL-17过表达模型组和IL-17沉默模型组，前6组每组各9只，后2组每组各6只。大鼠右后足足垫部皮内注入弗氏完全佐剂0.15 ml制作RA模型。造模后第2天进行慢病毒注射建立IL-17基因过表达、IL-17基因沉默模型。造模后第7天开始麦粒灸大鼠“肾俞”“足三里”两穴各5壮,每日1次,治疗18天。观测计算大鼠足跖肿胀度；采用ELISA双抗夹心法检测大鼠血清IL-17、TNF-a、IL-1b含量。结果：造模后模型组大鼠右后足容积显著高于空白组(P<0.01)，麦粒灸后艾灸组大鼠右后足容积显著低于模型组(P<0.01)。造模后模型组大鼠血清IL-17、TNF-a、IL-1b显著高于空白组；麦粒灸后艾灸组大鼠血清IL-17、TNF-a、IL-1b显著低于模型组。麦粒灸后IL-17过艾组大鼠血清TNF-a含量显著高于艾灸组(P<0.01)；IL-17沉艾组大鼠血清TNF-a含量显著低于艾灸组、空白组。麦粒灸后IL-17过艾组、IL-17沉艾组IL-1b含量与艾灸组相比，没有显著性差异。结论：麦粒灸可能通过调控IL-17从而调节RA大鼠血清TNF-a含量，起到抑制RA滑膜炎症的作用。

麦粒灸；类风湿性关节炎；IL-17；TNF-a；IL-1b；抗炎

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性自身免疫性疾病，其特点是关节滑膜的慢性炎性反应、软骨吸收、骨质破坏。促炎细胞因子TNF-a、IL-1b是诱导RA滑膜炎的“中心罪犯”，能够协同促进RA滑膜炎血管翳增生，引起滑膜后期骨破坏[1-5]。最新的研究表明[6-8]，IL-17是RA重要的促炎因子，在RA急慢性滑膜炎转化及慢性滑膜炎、骨破坏中发挥重要作用，可能与TNF-a、IL-1b一起协同加重RA滑膜炎，诱导RA滑膜炎急-慢性转化，促进RA后期骨破坏。

大量实验研究表明，麦粒灸治疗RA具有确切抗炎效应。其抗炎效应的发挥，是通过抑制促炎细胞因子TNF-a、IL-1b的分泌，从而缓解滑膜炎症,预防RA后期骨破坏[9-10]。但是，麦粒灸治疗RA抗炎效应的作用机制是否有IL-17参与、艾灸是否能够通过调控IL-17抑制滑膜炎的重要促炎因子TNF-a、IL-1b从而发挥抗炎效应，国内研究尚处空白阶段，值得进一步探索。

本实验首次应用siRNA干扰技术建立IL-17基因过表达、IL-17基因沉默模型，检测艾灸对弗氏佐剂关节炎大鼠模型、IL-17基因过表达AA大鼠模型、IL-17基因沉默大鼠模型血清IL-17、TNF-a、IL-1b的影响，初步探索IL-17在艾灸抗炎机制中的作用，进一步揭示艾灸治疗RA抗炎效应的IL-17促炎信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康成年SD大鼠66只，体质量(200±20)g，雄性，购于苏州西山生物技术有限公司[实验动物质量合格证编号：SCXK(H)2113-0003]，饲料由南京安立默科技有限公司提供。动物在实验前适应性驯养3周，动物房温度、湿度分别维持在20°C、70%左右，自由饮食和饮水。

1.2 药品与试剂

弗氏完全佐剂(FCA，美国sigma公司生产，批号Lot88H8804)；大鼠IL-17A基因(NM_001106897.1)(477bp)过表达;沉默慢病毒试剂(深圳市百恩维生物科技有限公司)；麦粒灸所用60∶1精艾绒(河北衡水医疗机械有限公司)；医用白凡士林(北京医疗机械有限公司)；艾草香(上海医疗机械有限公司)；黄芩油膏(江苏省中医院)；75%酒精(南京鑫尔医疗机械有限公司)。

1.3 仪器设备

足容积测量仪采用成都泰盟科技公司(pv-200足趾容积测量仪)；脱脂棉球(南京鑫尔医疗机械有限公司)；微量注射器(128538069111,上海高歌医疗机械有限公司);线手套(南京医疗机械有限公司)；充电式剃毛刀(深圳柯德士电器有限公司)。

1.4 动物分组

将大鼠用SPSS17.0统计软件程序生成的随机数字表随机分为空白组、空白艾灸组、模型组、艾灸组、IL-17过表达模型艾灸组(IL-17过艾组)、IL-17沉默模型艾灸组(IL-17沉艾组)、IL-17过表达模型组、IL-17沉默模型组，前6组每组各9只，后2组每组各6只。

1.5 RA模型复制

除空白组、空白艾灸组外，参照文献[11],于实验开始第1天，用75%酒精消毒大鼠右足，从大鼠右后足的足垫部皮内注入弗氏完全佐剂0.15 ml，建立RA模型。

1.6 IL-17过表达、沉默RA模型塑造

于弗氏完全佐剂造模成功后第1天,参照文献[12]，在无菌条件下，用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g对大鼠进行腹腔麻醉，酒精棉球消毒RA大鼠右踝关节，分别采用两支不同的经高压灭菌的微针注射器，在IL-17过艾组大鼠、IL-17沉艾组、IL-17过表达组、IL-17沉默组大鼠右踝关节腔缓慢注射IL-17A基因过表达慢病毒试剂、IL-17A基因沉默慢病毒试剂各40 ul，建立的大鼠IL-17过表达、IL-17沉默RA模型。

1.7 艾灸治疗

实验第7天开始,将空白艾灸组、艾灸组、IL-17过艾组、IL-17沉艾组大鼠固定在鼠台上,用麦粒灸(每壮约5 mg艾绒)灸“肾俞”“足三里”各5壮,每日1次,左右交替,6天为一疗程,共治疗3个疗程,每个疗程后休息1天。空白组、模型组、IL-17过表达组、IL-17沉默组同法固定,做对照处理。

1.8 行为学测试

足跖肿胀度：在注射 FCA 前及第7、13、19、25和31天测致炎侧关节足容积且做好记录，测量方法：将大鼠致炎侧踝关节呈测量时自然下垂角度，在毛发与足趾皮肤分界线处画线，包裹住整个踝关节，将大鼠右侧足缓慢放入盛有水的足容积测量仪烧杯中，待画线水平面与烧杯水面同齐，此时足容积测量仪发出嘀嘀声，按下踏板，记录足容积数值，测量3次，取平均值，误差值大小不超过0.2 ml。按(造模后足容积-造模前足容积)/造模前足容积的方法计算足肿胀度。

1.9 血液样本采集及检测方法

实验结束后禁食12 h，称重，用10%水合氯醛0.35 ml/100 g进行腹腔麻醉，将大鼠活体取材：股动脉穿刺取血,用肝素钠抗凝管采血5 ml,静置1 h后,4℃离心(3 000 r/min)10 min,分离出血清0.5 ml,-70℃冰箱保存待测。IL-17、RANKL均在南京凯基生物公司检测。

1.10 IL-17、TNF-a、IL-1b检测

在实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡室温。浓缩洗涤液以双蒸水稀释(1∶20)，其余放回4℃。加入标准品/标本稀释液1 ml至冻干标准品中，静置15 min，溶解后，轻微混匀(浓度为4000 pg/ml)。再根据需用量进行稀释。标准曲线浓度：4000，2000,1000，1000,500, 250,125,62.5,31.625,0 pg/ml。稀释完成前提前20 min，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1∶30)成工作浓度。然后按当次试验所需要的用量，提前20 min，以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶30)成工作浓度。随机将平衡至室温的密封袋中取出试验板条，空白孔加标本或标准品稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板5次。然后，空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60 min。洗板5次。接着，空白孔加提前20 min准备好的酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 ul/孔)，封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30 min。随后打开酶标仪电源，预热仪器并设置好程序。洗板同上。洗板后，加入显色底物100 ul/孔，避光36℃孵育15 min。加入终止液100 ul/孔,混匀后(3 min内)即刻测量OD450值。每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值。最后进行手工绘制标准曲线，标准品浓度为横坐标，OD值是纵坐标，曲线为滑线，根据标本的OD值查出其浓度。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠右后足肿胀度比较

为了研究麦粒灸的抗炎效应，实验首先进行大鼠右后足肿胀度行为学测试。见表1和封三彩图1、2,实验结果表明，造模后模型组大鼠、艾灸组大鼠、IL-17过表达组大鼠、IL-17过艾组大鼠、IL-17沉默组大鼠、IL-17沉艾组大鼠右后足肿胀度明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义，说明造模成功。在接受18天麦粒灸治疗后，艾灸组大鼠、IL-17过艾组大鼠、IL-17沉艾灸组大鼠右后足肿胀度明显下降(P<0.01)，说明麦粒灸能够降低关节炎大鼠右后足趾肿胀度、缓解关节炎疼痛，从而达到抗炎效果。

表1 各组大鼠右后足肿胀度比较(±s)

注：与空白组比较，ΔΔP<0.01；与模型组比较，**P<0.01；与艾灸组比较，○P<0.05

2.2 各组大鼠血清IL-17、TNF-a和IL-1b含量比较

在证明了麦粒灸对RA大鼠右后足的抗炎效果后，用ELISA法检测各组大鼠IL-17、IL-1b、TNF-a含量，探讨麦粒灸对于RA大鼠血清促炎细胞因子IL-17、TNF-a以及IL-1b含量影响。见表2～4、图3、5、6,实验结果表明，麦粒灸治疗18天后，血清空白艾灸组与空白组比较，IL-17、TNF-a含量没有显著性差异，说明麦粒灸对正常大鼠血IL-17、TNF-a含量没有影响。模型组与空白组相比，大鼠血清IL-17、TNF-a、IL-1b含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明促炎因子IL-17、TNF-a在RA炎症发作期含量明显上升，参与RA炎症活动过程。艾灸组与模型组相比，艾灸组能够明显降低模型组大鼠IL-17、TNF-a、IL-1b含量，差异有统计学意义(P<0.05)，说明麦粒灸可能通过抑制促炎因子IL-17、TNF-a、IL-1b含量，发挥其抗炎效应。

为了进一步研究IL-17对RA滑膜炎重要的促炎因子IL-1b和TNF-a的作用,通过应用关节腔注射IL-17基因沉默、IL-17基因过表达来探索IL-17对艾灸血清IL-17、TNF-a、IL-1b的影响。见表2～4、图4～6,实验结果表明，在注射了IL-17过表达慢病毒之后，IL-17过表达组与模型组相比，IL-17含量显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，说明IL-17过表达模型成功。IL-17沉默组与模型组相比，IL-17含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05),说明IL-17沉默模型成功。在造模30天、麦粒灸18天后，IL-17过表达组与模型组相比TNF-a含量明显上升(P<0.05)，差异有统计学意义；IL-17过艾组与艾灸组相比TNF-a含量明显上升(P<0.05)，差异有统计学意义,说明IL-17过表达可以阻断麦粒灸对于TNF-a因子的调节效果。而在造模30天、麦粒灸18天后，IL-17沉默组与模型组相比，TNF-a含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-17沉艾组与艾灸组、空白组相比，血清TNF-a表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，说明麦粒灸联合IL-17沉默对血清TNF-a的抑制效果要比单独IL-17沉默或单独艾灸要更好。相反的是，造模26天后IL-17过表达组与模型组相比，IL-1b水平显著升高差异有统计学意义(P<0.01)，说明IL-17参与调控IL1-b表达;而IL-17过艾组、IL-17沉艾组与艾灸组相比，IL-1b含量没有显著性差异，说明IL-17过表达或沉默并不能影响麦粒灸对IL-1b水平的调整。

表2 各组大鼠血清IL-17含量比较

注：与空白组比较，ΔΔP<0.01；与模型组比较，**P<0.01；与艾灸组比较，○○P<0.01

图3 空白组、空白艾灸组、模型组、艾灸组大鼠血清IL-17含量比较

图4 各组大鼠血清IL-17含量比较

组别例数TNF-a(pmol/L)空白组928．82±9．28空白艾灸组831．25±8．80模型组8143．22±11．94ΔΔ艾灸组972．67±5．54∗∗IL-17过艾组8114．89±9．94○IL-17沉艾组838．79±16．07○○ΔΔIL-17过表达组6234．81±11．25∗IL-17沉默组676．37±10．06∗

注：与空白组比较，ΔΔP<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01;与艾灸组比较，○P<0.05，○○P<0.01

图5 各组大鼠血清TNF-a含量比较

组别例数IL-1b(pmol/L)空白组977．10±1．94空白艾灸组879．47±1．38模型组8267．89±4．57ΔΔ艾灸组9214．28±3．85∗∗IL-17过艾组8208．83±7．21IL-17沉艾组8216．55±3．74IL-17过表达组6319．26±10．26∗∗IL-17沉默组6252．20±7．40

注：与空白组比较，ΔΔP<0.01；与模型组比较，**P<0.01

图6 各组大鼠血清IL-1b含量比较

3 讨论

本试验结果发现，麦粒灸能够显著降低完全弗氏佐剂造模(AA)关节炎大鼠血清升高的促炎细胞因子IL-17、TNF-a、IL-1b含量。在这其中，麦粒灸对于TNF-a含量的调节作用受血清IL-17促炎因子的调控；麦粒灸与IL-17能够协同下调血清TNF-a含量，麦粒灸加IL-17沉默对于血清TNF-a抑制效果比单纯麦粒灸或单纯IL-17沉默要更好。虽然IL-17过表达可以引起IL-1b含量升高，但是麦粒灸对IL-1b含量的调控不受IL-17过表达或沉默影响。实验说明，麦粒灸可能通过下调血清IL-17含量从而调节TNF-a含量；而麦粒灸对IL-1b含量的调控则可能不仅只通过IL-17起作用，而是受多因素影响的。

RA是临床上常见的致残性、自身免疫性疾病，滑膜炎症是 RA 的最突出病理特征，贯穿于RA 整个病理过程始终。大量基础研究证实，滑膜细胞的异常致炎、类肿瘤样生长及骨破坏与炎性细胞因子及其炎症信号通路转导密切相关。在关节炎病程中，炎性细胞因子TNF-a和IL-1β是导致RA滑膜炎和骨破坏的“中心罪犯”。CD4+T细胞异常活化,分泌炎性细胞因子白介素IL1-1b、肿瘤坏死因子TNF-a等作为第一信使与滑膜细胞上相应受体结合，把细胞外信号传导至细胞内，引起细胞内酪氨酸激酶磷酸化，激活 NF-k B、JAK-STAT等炎性信号通路，调节相关转录因子活性，调控相关炎性基因表达，从而促使炎症加重、滑膜细胞增生、血管翳形成，引起滑膜细胞的持续性炎症[13-18]。因此，笔者从与RA滑膜炎关系最密切的促炎细胞因子TNF-a和IL-1b入手，研究麦粒灸调控IL-17对RA抗炎效应的作用机制。

Th17细胞是最新发现的一种新辅助性CD4+T细胞亚群，IL-17是由Th17细胞分泌的重要促炎因子。实验证明IL-17在RA滑膜炎由急性向慢性转化、RA关节骨破坏中发挥重要促炎作用、加速RA后期骨破坏进程。2008 年 Hideki Ogura等在国际著名的免疫学杂志 《Immunity》(IF:24.2)上发表文章，首次阐明了IL-17A介导的IL-17A-STAT3炎性细胞信号正反馈通路在RA关节急-慢性炎症转化中可能发挥重要作用。此外，IL-17还诱导TNF-a的产生并与其有协同作用，导致炎性反应的持续发生和软骨与骨的渐进性破坏[19-22]。

本试验结果发现，麦粒灸能够显著降低完全弗氏佐剂造模(AA)关节炎大鼠血清升高的促炎细胞因子IL-17、TNF-a、IL-1b含量,说明麦粒灸可能通过抑制促炎细胞因子IL-17、TNF-a、IL-1b,抑制RA急、慢性滑膜炎进程。除此之外，本实验还首次应用了IL-17基因过表达、IL-17基因沉默两种模型，探索IL-17在麦粒灸治疗RA抗炎效应的作用机制。实验结果表明，IL-17过表达可以阻断麦粒灸对于TNF-a含量的抑制作用。说明麦粒灸对于血清TNF-a的调节作用，依赖于IL-17的参与。实验首次揭示了IL-17是TNF-a的上游调控因子，麦粒灸通过调控IL-17从而影响TNF-a含量，麦粒灸对RA滑膜炎发挥抗炎效应的作用机制，有赖于对促炎因子IL-17的调控。值得一提的是，实验发现麦粒灸能与IL-17能够协同下调血清TNF-a含量，麦粒灸加IL-17沉默对于血清TNF-a抑制效果比单纯艾灸或单纯IL-17沉默要更好，说明临床上可以应用IL-17抑制剂加麦粒灸联合治疗来抑制RA滑膜炎，为RA治疗提供了新的治疗手段和应用前景。但是，实验也发现虽然IL-17过表达可以引起IL-1b水平升高，但是麦粒灸对IL-1b水平的调控，不受IL-17变化的影响，说明艾灸对IL-1b促炎因子的影响，具有多因性。

本实验主要探讨了IL-17对RA滑膜炎抗炎细胞因子的可能作用机制，对于STAT3、NF-kb等促炎信号通路的重要信号因子在本次实验中还尚未涉及，拟在下一步实验进行继续探索。

4 结论

本实验研究结果显示，麦粒灸可以显著降低RA模型大鼠踝关节肿胀度以及血清IL-17、TNF-a、IL-1b含量。在将IL-17过表达或沉默后，血清TNF-a水平发生显著变化。说明麦粒灸可能通过调控IL-17，从而调节RA大鼠血清TNF-a含量，起到抑制RA滑膜炎症的作用。

致谢:感谢南京中医药大学动物实验中心对本实验的协助；感谢在动物实验过程中姜姝姝、高宇晨两位硕士对本实验的协助。

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国家自然科学基金青年基金项目,编号:81202741；教育部高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题,编号:20123237120009。

高梓珊(1982-),女，讲师，研究方向：针灸抗炎、镇痛神经生物学和免疫学机制研究。

R246.2

A

1005-0779(2017)01-0037-05

2016-06-04