丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及机制

赵素晨 吴庆文 程月发 贾玉凤 陈 娟 闫春林

(华北理工大学护理与康复学院，河北 唐山 063000)

丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及机制

赵素晨1吴庆文 程月发2贾玉凤 陈 娟 闫春林

(华北理工大学护理与康复学院，河北 唐山 063000)

目的 探讨丁苯酞对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的人体神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞凋亡途径的保护作用及其机制。方法 体外培养SH-SY5Y细胞，建立MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型。应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同剂量丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响；筛选出丁苯酞的最佳作用浓度；Annexin-V/PI流式细胞分析术检测细胞凋亡率；倒置相差显微镜观察细胞形态的变化；Western印迹法检测线粒体相关凋亡蛋白P53、Bcl-2、Bax的表达。结果 丁苯酞预处理的细胞比单纯MPP+处理的细胞存活率增加(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖性；丁苯酞可以降低MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡率(P<0.05)。丁苯酞下调P53、Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)。结论 丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有一定的保护作用，其机制可能是调节P53、Bcl-2、Bax的表达，抑制细胞凋亡的发生。

丁苯酞；帕金森病；SH-SY5Y细胞；凋亡

帕金森病(PD)主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失和纹状体多巴胺含量显著减少，而多巴胺神经元广泛的缺失是形成障碍的最重要原因〔1〕。现行药物只能缓解疾病症状并不能彻底阻止疾病发展〔2〕。中药在治疗PD病方面具有临床应用经验丰富、作用途经靶点多、副作用小等潜在优点，在临床上的应用越来越广泛，从中药中获取活性成分成为寻求预防和治疗PD的重要途径〔3〕。丁苯酞为脂溶性的药物，可以直接通过血脑屏障发挥作用，重构缺血区微循环，保护线粒体免受损伤，改善能量代谢〔4～7〕。本实验应用丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞进行预处理，观察对线粒体凋亡通路相关蛋白P53、Bcl-2、Bax表达变化。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物、试剂及仪器 SH-SY5Y细胞株购自中国科学院昆明细胞库。丁苯酞购于中国食品药品检定研究院。MPP+、MTT、Annexin-V/PI试剂盒均购于Sigma公司；DMEM/F12=1∶1培养基、胰酶、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司；GAPDH抗体(华安生物技术有限公司)，P53、Bcl-2、Bax抗体(巴傲得生物科技有限公司)。CO2培养箱、酶标仪(意大利Bio-Rad公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)，流式细胞仪(FACS Calibuar，BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 SH-SY5Y细胞接种于培养瓶中，DMEM/F12培养基(含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)，置于37℃、5%CO2培养箱培养。实验分为对照组，模型组，丁苯酞组。

1.2.2 MTT比色法检测细胞存活率 以每孔(1～5)×104个/ ml的活细胞悬液100 μl接种于96孔板中，不同剂量(1、10、20、100 μmol/L)丁苯酞预先处理2 h后加入1 mmol/L MPP+继续培养24 h后各组分别加入50 mg/ml的MTT 15 μl继续孵育3 h，吸去培养基，加入150 μl的DMSO，摇床10 min，酶标仪490 nm波长检测吸光度值(OD值)，计算细胞生长抑制率，实验重复3次。

1.2.3 Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡 以每孔(2～5)×105个/ml的密度接种于6孔板中，用最佳浓度丁苯酞预先作用2 h后加入1 mmol/L的MPP+继续培养24 h后，胰酶消化，收集细胞，PBS清洗，加入400 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min，加10 μl的PI染色液混匀，室温避光孵育5 min，随即进行流式细胞仪检测分析。以上实验重复3次。

1.2.4 Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达情况 细胞干预情况同上，每孔加入60 μl裂解液，用细胞刮刮掉细胞，放入EP管中，超声打碎，离心，取上清。用BCA试剂盒检测样品浓度进行蛋白定量。蛋白变性，SDS-PAGE电泳，采用湿转转膜，5%牛奶封闭1 h，一抗4℃摇床过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL显色，用ImageJ软件对结果进行分析。以上实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 丁苯酞对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响 模型组〔(39.50±4.05)%〕与对照组〔(100.08±0.00)%〕比较，细胞相对存活率明显降低(P<0.05)，而给予1、10、20、100 μmol/L丁苯酞预处理后的细胞存活率高于模型组，相对存活率分别为(56.76±3.70)%、(74.00±6.24)%、(81.47±7.45)%、(78.93±1.21)%(P<0.05)，丁苯酞浓度为20 μmol/L时，细胞存活率最高，为最佳浓度。后续研究选择20 μmol/L丁苯酞作为治疗剂量。

2.2 细胞形态学的改变 模型组细胞大部分变圆，突起结构减少，贴壁细胞数目减少，丁苯酞预处理组，亦有变圆的现象，但比模型组贴壁细胞增多，细胞间的突起联系增多且细胞形态逐渐接近对照组，见图1。

2.3 细胞凋亡率的变化 模型组与对照组相比凋亡率明显升高〔(30.04±2.14)% vs (8.72±0.99)%，P<0.05〕，丁苯酞组与模型组相比，凋亡率明显下降〔(16.84±0.54)%，P<0.05〕。

2.4 Western印迹法检测P53、Bcl-2、Bax蛋白的表达 模型组P53、Bax蛋白的表达量较对照组明显升高(P<0.05)，丁苯酞组P53、Bax蛋白的表达量较模型组明显降低(P<0.05)；模型组Bcl-2蛋白表达量较对照组明显降低(P<0.05)，丁苯酞组Bcl-2蛋白表达较模型组明显升高(P<0.05)，见图2，表1。

图1 各组细胞形态学的变化(HE，×400)

图2 Western印迹法检测凋亡相关蛋白的变化

组别P53Bcl⁃2Bax对照组050±0041)084±0001)055±0011)模型组082±001045±000089±003丁苯酞组060±0031)075±0021)067±0021)

与模型组比较：1)P<0.05

3 讨 论

PD主要病理变化为中脑黑质致密部多巴胺神经元的大量缺失，从而导致基底节功能性减退〔8，9〕。在PD的发生发展进程中，细胞凋亡是重要的病理性过程，与其相关的细胞信号转导因子包括死亡受体、Bcl-2家族、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、钙激活酶、周期素依赖性激酶5、p53、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1等〔10～12〕。目前认为关于细胞凋亡过程中信号转导系统主要通路有两条：膜受体通路和线粒体通路。线粒体途径在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。研究表明，丁苯酞可有效提高线粒体膜流动性，增加神经细胞线粒体ATP酶活性，稳定线粒体膜及增加线粒体ComplexⅣ的活性〔13〕。丁苯酞治疗PD的临床实践已有相关报道，张霞萍等〔14〕研究发现，丁苯酞对中晚期PD患者治疗中出现运动波动等并发症及非运动症状有一定疗效。刘建国等〔15〕通过对4例临床病例的观察发现，丁苯酞对神经变性疾病及神经遗传疾病有治疗作用，可能是通过改善线粒体功能而发挥作用。贾敏等〔16〕通过鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞，用丁苯酞预处理过的SH-SY5Y细胞，其细胞形态的变化小，活性下降程度轻，线粒体膜电位降低幅度小，表明丁苯酞可能有抑制细胞凋亡效应，从而发挥其神经保护作用。

本研究显示，丁苯酞预处理的细胞存活率明显高于单独MPP+诱导的细胞，在一定范围内，随丁苯酞浓度的升高，细胞存活率逐渐升高，当浓度达到一定值时，细胞存活率反而有所下降，可能是由于药物浓度过大，对细胞产生了毒性作用。丁苯酞预处理可以抑制MPP+诱导的细胞凋亡，降低细胞凋亡率，对细胞起到保护作用，这与贾敏等〔16〕的研究结果相一致。

细胞凋亡机制中，P53基因是一种重要的促凋亡基因，由P53介导的凋亡途径主要包括两条〔17〕：一条是P53对外源性凋亡途径的调节，主要通过激活位于血浆膜的死亡受体如Fas、DR4、DR5等促进细胞凋亡。另一条是P53对内源性凋亡途径的调节，主要通过线粒体调控，由于此凋亡途径中Bcl-2蛋白和线粒体腺苷酸三磷酸酶蛋白的变化依赖P53的调控，因此又称为P53介导的线粒体依赖凋亡途径。其中在P53调控凋亡相关基因的转录中，Bcl-2蛋白家族成员中Bax是P53调控的重要靶基因之一。Bax作为P53的下游调控基因，被P53蛋白激活转录，从而Bax蛋白表达比例上调而Bcl-2蛋白的比例下调诱导细胞凋亡〔18〕。

本实验说明MPP+作用SH-SY5Y细胞后引起了细胞凋亡。丁苯酞通过降低促凋亡蛋白的表达，提高抗凋亡蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡。因此，推测丁苯酞对MPP+诱导的细胞损伤具有一定的保护作用，且这种保护作用的机制可能是通过下调P53、Bax的表达，上调Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡的发生。

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〔2015-08-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

吴庆文(1966-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事康复医学、神经康复研究。

赵素晨(1988-),女，硕士，住院医师，主要从事神经康复研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)02-0316-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.024

1 襄阳市中心医院康复医学科 2 华北理工大学冀唐学院