蚕砂叶绿素水提物光动力疗法对痤疮丙酸杆菌体外抑制实验研究

施建新 闵仲生

江苏省中医院，江苏 南京 210029

蚕砂叶绿素水提物光动力疗法对痤疮丙酸杆菌体外抑制实验研究

施建新 闵仲生*

江苏省中医院，江苏 南京 210029

目的：评估蚕砂叶绿素水提物光动力疗法在体外对痤疮丙酸杆菌的抑制效应。方法：以96孔板为实验载体，加入痤疮丙酸杆菌，分为实验组、蚕砂组、细菌红光组及细菌组，采用半导体固态冷光源，进行光动力治疗。结果：1000mg/mL蚕砂联合光动力疗法组各浓度的培养皿中未见菌落产生，其余各蚕砂PDT组培养皿中未均见菌落产生。蚕砂组、细菌组、细菌红光组培养皿中均可见菌落产生。而对照组中痤疮丙酸杆菌生长未受抑制。结论：临床使用蚕砂叶绿素水提物联合光动力疗法治疗丙酸杆菌所致痤疮具有一定可行性，其疗效可在今后临床试验中进一步观察。

蚕砂叶绿素水提物；光动力疗法；痤疮丙酸杆菌；体外实验

寻常痤疮是一种临床常见毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，各年龄皆可发病，以青少年发病率为最高[1]。因其具有一定的损容性，其治疗包括外用药物治疗、系统治疗与物理治疗，随着科技的发展其治疗方式与方法也再不断更新。光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种近年来应用于多种疾病治疗的治疗方法，光动力疗法选择性杀伤肿瘤细胞和增生旺盛的细胞是其最大的特点，而对正常细胞无损伤，从2000年首次报道治疗痤疮有效以来[2]，目前的文献多集中报道光动力治疗痤疮的有效性，少见纯中药提取物进行光动力治疗痤疮。本文旨在通过体外实验，通过蚕砂叶绿素水提物光动力疗法的实验，探索对不同浓度痤疮丙酸杆菌的体外抑制效果，寻找一个最低的有效浓度，为以后临床应用寻找新的思路。

1 仪器与材料

1.1 菌株与试剂 痤疮丙酸杆菌标准菌株(Propionibacterium acnes，ATCC11827，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心)；蚕砂叶绿素提取物(江苏省中医院制剂科)；琼脂(L3027，美国Sigma-Aldrich公司)；PBS缓冲液(0.03mol/L，使用前配制)。

1.2 仪器 高能窄谱光动力治疗仪，红光波长为(640±10)nm，输出功率2～230mW，由安徽航天生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 痤疮丙酸杆菌悬液的制备 在微生物限度室复活痤疮丙酸杆菌冻干粉，复活成功后增殖培养，测定痤疮丙酸杆菌浓度，调整最大浓度为1.7×108CFU/mL(Colony Forming Units)，依次稀释至1.7×107CFU/mL、1.7×106CFU/mL、1.7×105CFU/mL、1.7×104CFU/mL。加入96孔板中，每孔菌液200μL。

2.2 痤疮丙酸杆菌的分组 将痤疮丙酸杆菌分成：①实验组：96孔板分别加入对应浓度蚕砂叶绿素水提物100μL，终末浓度分别为1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.2mg/mL、15.6mg/mL，并充分混匀，每组设6个复孔，置于37℃避光孵育15min。②3个对照组：细菌组：单纯不同浓度痤疮丙酸杆菌悬液，无照光处理；细菌红光组：单纯不同浓度痤疮丙酸杆菌悬液，只予半导体固态冷光源照射；蚕砂组：不同浓度痤疮丙酸杆菌悬液加入不同浓度蚕砂叶绿素水提物酸共同孵育，无半导体固态冷光源照射，每组设6个复孔，置于37℃避光孵育15min。

2.3 半导体固态冷光源照射 将96孔板垂直置于光源下20cm，使光斑直径为10cm，刚好将细菌孔完全覆盖，光照能量设定为80mW/cm2，照射时长为15min。按照上述办法将实验组和对照组中的b组进行照射。

2.4 判断抑菌效果 照光结束后，每组各孔吸取100μL菌液，混合后，每组取0.5mL混合液，浇板，37℃厌氧培养2d，记录痤疮丙酸杆菌是否增长。

3 结果

对本研究的痤疮丙酸杆菌的生长情况进行统计，见表1～3。研究中，1000mg/mL实验组各浓度的培养皿中未见菌落产生，其余各实验组培养皿中未见菌落产生。蚕砂组、细菌组、细菌红光组培养皿中均可见菌落产生。而对照组a、b、c中痤疮丙酸杆菌生长未收到抑制，说明单纯照光与只加蚕砂叶绿素水提物不照光，均不能抑制细菌的生长。

表1 三次处理后蚕砂组P.acnes生长情况 (CFU/mL)

注：(+)表示可见菌落生长。

表2 三次处理后细菌组和细菌红光组P.acnes生长情况 (CFU/mL)

注：(+)表示可见菌落生长。

表3 三次处理后实验组P.acnes生长情况 (CFU/mL)

注：(-)表示未见菌落生长，(+)表示可见菌落生长。

4 讨论

痤疮的发生主要与雄激素与皮脂增加、毛囊皮脂腺过度角化、痤疮丙酸杆菌及继发炎症反应等原因相关。一般认为痤疮丙酸杆菌产生的各类生物酶，能分解甘油三酯，释放具有生物活性的组胺、细胞趋化物质、短链脂肪酸等参与炎症反应，其细胞成分中的肽聚糖可被TLR2识别，并启动免疫应答[3]。光动力疗法是近年来迅速发展起来治疗痤疮的一项新型技术，是应用特定波长光源与光敏剂，通过光动力学效应选择破坏病变组织的治疗技术。氨基酮戊酸光动力疗法现已被证实可以杀死细菌、真菌和酵母等微生物[4-5]。

蚕砂提取的叶绿素a的在外加激发光源以后，即可产生光化学反应[6]，其主要的吸收峰存在于光谱中红光部分的640～660nm和蓝光部分的430～450nm处。早在20世纪80年代，就已经制成性质稳定性，亲水性良好的叶绿素衍生物，主要是通过从蚕砂中提取糊状的叶绿素，然后进行皂化，最后通过加入重金属盐的方法来取代中心镁原子的方法制成。通过以上方法制成的叶绿素衍生物，它的治疗波长介于400～700nm之间，值得注意的是在415nm和630～664nm处也具有两个吸收最高峰值[7]，这与天然的叶绿素a治疗峰值基本吻合，表明其光动力激发波段并没有受到影响。值得注意的是，叶绿素治疗痤疮已有临床报道，Kim JE等[8]已经应用提纯后的叶绿素a、叶绿素b通过光动力疗法治疗痤疮。

氨基酮戊酸是卟啉、血红蛋白、叶绿素等四吡咯生物合成的中间产物。叶绿素a的合成过程由2分子ALA开始，通过一系列反应，生成原卟啉Ⅸ, 原卟啉Ⅸ之前的在是叶绿素与血红蛋白生物合成中都是一样的，下一步反应中PpⅨ与亚铁结合就成亚铁血红素，而PpⅨ与镁结合就成镁原卟啉。镁原卟啉再接受甲基、环化后成为具有第Ⅴ环的原脱植醇基叶绿素，最终形成叶绿素a。

本实验结果表明，考虑到ALA-PDT体外抑制P.acnes生长的结果[9]，蚕砂叶绿素水提物同样具有良好抑制作用。实验组中1000mg/mL 的细菌生长被抑制，然而1000mg/mL蚕砂组细菌的生长依旧生长，说明此次实验中，痤疮丙酸杆菌在细胞外浓度的改变的情况下，并没有出现痤疮丙酸杆菌破裂、死亡的现象。另外几组浓度下的实验组未能抑制P.acnes生长，说明此次蚕砂叶绿素水提物浓度已成为能达到有效的抑菌浓度。因为本次实验并没有设置孵育时间，考虑叶绿素本身的疏水性，所以假设痤疮丙酸杆菌外是发生光化学反应的主要场所。细胞外直接发生的光化学反应可能直接损伤痤疮丙酸杆菌的细胞壁，当损伤达到一定程度时，痤疮丙酸杆菌的生长被完全抑制，所以叶绿素提取物浓度越高，P.acnes损伤程度也就越高，抑制效果应当越明显，推测一定浓度范围内叶绿素浓度与抑制效果应当是一个线性的关系，且结果也符合以上推测。表1～2结果表明，光动力效果的要素缺一不可，缺少了光照、光敏剂都不能产生光动力效应，不能产生应抑菌的效果，本实验完全符合光动力实验的特性。

通过试验可以发现，蚕砂叶绿素水提物光动力疗法可以抑制P.acnes体外的生长，为进一步探索蚕砂叶绿素水提物临床治疗痤疮的可能性，发挥我国中医药在治疗痤疮方面的优势提供了实验依据。

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[9] 施建新, 闵仲生.5-氨基酮戊酸光动力疗法对痤疮丙酸杆菌体外抑制的实验研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志, 2015, 14(5):282-284.

(编辑：梁志庆)

Inhibitory Effect of Silkworm Chlorophyll Extract Photodynamic Therapy on Propionibacterium Acnes

SHI Jianxin MIN Zhongsheng*

Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China

Objective To evaluate the effect of silkworm chlorophyll extract photodynamic therapy on Propionibacterium acnes.Methods 96-well cell culture plates were used for experimental carriers and Propionibacterium acnes suspension was added to these wells,which were divided into experimental group and three control groups.With Semiconductor as the exctiation source.Results 1000mg/mL Silkworm-PDT group can completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes， the rest Silkworm-PDT group can’t completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes.Silkworm groups, the group of bacteria and bacterial phototherapy groups can’t completely inhibited the growth of each concentration of P.acnes.The growth of P.acnes was not inhibited in three control groups.Conclusion The experimental results provide the experimental basis for the clinical use of silkworm chlorophyll extract in the treatment of acne.

Silkworm Sand Chlorophyll Aqueous Extract；Photodynamic Therapy；Propionibacterium Acnes；In Vitro Studies

2016-11-12

施建新(1987-)，男，汉族，住院医师，硕士，研究方向为中西医结合皮肤性病学基础与临床。E-mail：mervynshi@foxmail.com

闵仲生(1957-)，男，汉族，主任医师，教授，研究方向为中西医结合皮肤性病学基础与临床。E-mail：minzhsh@sina.com

R246.7

A

1007-8517(2017)02-0041-03