千金片对慢性盆腔炎大鼠Th1/2型细胞因子表达的影响

赵 杰 刘 芳

(内蒙古医科大学附属医院生殖中心，内蒙古 呼和浩特 010050)

千金片对慢性盆腔炎大鼠Th1/2型细胞因子表达的影响

赵 杰 刘 芳

(内蒙古医科大学附属医院生殖中心，内蒙古 呼和浩特 010050)

目的 探讨妇科千金片对慢性盆腔炎大鼠子宫组织及血清中辅助性T细胞(Th)1/2型细胞因子表达的影响。方法 选取84只雌性SD大鼠，选取其中72只进行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后随机分为模型组(等量蒸馏水)、假手术组(等量蒸馏水)、千金片高剂量组(2.08 g/kg千金片)、千金片中剂量组(1.04 g/kg千金片)、千金片低剂量组(0.52 g/kg千金片)及妇炎康组(0.41 g/kg妇炎康)各12只，其余12只作为空白组(等量蒸馏水)。治疗21 d后检测各组大鼠子宫组织及血清Th1/2型细胞因子表达情况。结果 模型组、千金片低、中、高剂量组、妇炎康组的HE染色病理学评分显著高于空白组和假手术组(P<0.05)，千金片低、中、高剂量组、妇炎康组的HE染色病理学评分显著低于模型组(P<0.05)，千金片低、中、高剂量组随着千金片剂量增加，病理学评分逐渐降低(P<0.05)；模型组大鼠子宫组织中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8水平显著高于空白组、假手术组(P<0.05)，IL-10水平显著低于空白组、假手术组(P<0.05)；千金片高、中、低剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织中IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著低于模型组(P<0.05)、IL-10水平显著高于模型组(P<0.05)。模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平显著高于空白组、假手术组(P<0.05)，IL-10、干扰素(IFN)-γ、IL-12水平显著低于空白组、假手术组(P<0.05)；千金片高、中、低剂量组及妇炎康组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平显著低于模型组(P<0.05)、IL-10、干扰素(IFN)-γ、IL-12水平显著高于模型组(P<0.05)。结论 妇科千金片能有效抑制慢性盆腔炎大鼠IL-1β、TNF-α、IL-8水平表达，增强IL-10表达，从而达到抗炎的目的。

妇科千金片；慢性盆腔炎；辅助性T细胞；细胞因子

已婚女性由于性生活频繁、阴道内菌群环境失调等原因，阴道炎症以及慢性盆腔炎症性疾病的发生率逐渐增多，临床上可反复发生下腹部隐痛，部分患者慢性盆腔炎急性发作时可导致严重的全身炎症性症状。目前急性期盆腔炎一般采用第二代头孢类抗生素联合抗厌氧菌药物联合治疗〔1〕。妇科千金片中含有千金拔、 金樱根、 穿心莲等中药成分，可以显著改善盆腔炎急性期充血、抑制炎症反应，进而改善患者盆腔炎症〔2〕。但目前对于妇科千金片的作用机制尚不清楚，本文拟分析千金片对盆腔炎大鼠模型局部免疫平衡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 选取84只雌性SD大鼠，选取其中72只进行慢性盆腔炎大鼠造模，造模后随机分为模型组、假手术组、千金片高、中、低剂量组及妇炎康组各12只，其余12只作为空白组。所有大鼠均为SPF级，平均体重(200±20)g，购自中南大学湘雅医学院动物实验中心〔SCXK(湘)2014-0003〕，所有大鼠喂养于12 h光照、湿度40%～60%、温度23℃～25℃、自由进食进水的环境中。

1.2 造模方法 采用5 ml的注射空针将密度为5×106表皮葡萄球菌、 肠道埃希菌以及淋球菌性支原体混合注入培养瓶中混匀。将尾纱剪切成小块，与培养液充分混匀。将模型鼠倒立，将纱布塞入子宫内，注意观察有无明显出血，可局部纱布压迫止血，大鼠倒置5 min。1次/d，连续操作4次。假手术组塞入普通浸入生理盐水的纱布。

1.3 实验方法 千金片组的抗感染治疗分为不同的给药浓度，按0.52、1.04、2.08 g/kg静脉滴注给药，妇炎康组组按照浓度为0.41 g/kg 给予妇炎康药液，其余各组均给予生理盐水注射治疗，1次/d，连续 治疗4 w。

1.4 指标检测方法 酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-10、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8、IL-4、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-12，1 500 r/min离心5 min后得到血清，4℃保存待测，以标准品稀释液将标准品复溶，静置15 min后混匀。大鼠子宫组织经过研磨后倍比稀释为7个浓度，取出板条，除了对照孔外每孔加入不同浓度的标准品100 μl/孔，封板盖封住，室温反应120 min，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，除了空白对照孔，每孔加入检测液100 μl，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，加入底物(50 μl/孔)，避光孵育25 min，加入终止液5 min后测定450 nm处吸光度。苏木素-伊红(HE)染色:采用石蜡脱水，微波修复，柠檬酸缓冲液98℃，5 min，之后采用3%过氧化氢抑制10 min，在50%石蜡二甲苯液中浸蜡10 min，100%石蜡液中浸蜡10 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，HE复染、脱水(85% 1次、95% 2次、无水酒精二次、无水酒精和二甲苯各半1次、纯二甲苯2次),封片、镜检。HE染色评分标准：未见炎症细胞浸润计0分；子宫内膜中出现少量炎症细胞(≤30%)计1分；子宫内膜中出现大量炎症细胞(>30%)，腺上皮轻度增生，极性排列规则，计2分；间质出现大量的炎症细胞浸润(>30%)，腺上皮增生，极性排列紊乱，计3分。

1.5 统计学方法 采用SAS9.0软件，计量指标采用F检验，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 HE染色病理学观察 空白组和假手术组大鼠的子宫组织黏膜层、肌层、浆膜层组织清晰，未见炎症细胞浸润及炎性渗出；模型组大鼠子宫组织可见子宫黏膜上皮细胞大部分坏死脱落，腺体变形、扩张、弯曲，间质细胞减少，各层子宫组织结构紊乱、界限不清，可见纤维细胞增生及大量炎性细胞浸润及炎性渗出；随着千金片剂量增加，大鼠子宫组织较模型组改善显著。HE染色病理学评分结果可见，模型组〔(2.63±0.61)分〕、千金片低〔(2.13±0.57)分〕、中〔(1.64±0.60)分〕、高剂量组〔(0.75±0.42)分〕、妇炎康组〔(0.78±0.35)分〕的HE染色病理学评分显著高于空白组(0分)和假手术组(0分)(P<0.05)，千金片低、中、高剂量组、妇炎康组的HE染色病理学评分显著低于模型组(P<0.05)，千金片低、中、高剂量组随着千金片剂量增加，病理学评分逐渐降低(P<0.05)。见图1。

图1 各组HE染色病理学观察(HE，×200)

2.2 各组大鼠血清中Th1/2细胞因子的表达情况 模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平显著高于空白组、假手术组(P<0.05)，IL-10、IFN-γ、IL-12水平显著低于空白组、假手术组(P<0.05)；千金片高、中、低剂量组及妇炎康组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-4水平显著低于模型组(P<0.05)、IL-10、IFN-γ、IL-12水平显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠子宫组织中Th1/2细胞因子的表达情况 模型组大鼠子宫组织中IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著高于空白组、假手术组(P<0.05)，IL-10水平显著低于空白组、假手术组(P<0.05)；千金片高、中、低剂量组及妇炎康组大鼠子宫组织中IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著低于模型组(P<0.05)、IL-10水平显著高于模型组(P<0.05)。见表2。

组别IL-1β(μg/L)IL-10(μg/L)IL-8(μg/L)TNF-α(μg/L)IL-4(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-12(pg/ml)空白组149.3±8.975.2±6.2124.8±7.7100.2±7.321.3±5.739.6±5.244.6±7.1假手术组151.2±9.476.0±7.1125.0±8.5101.5±7.922.6±6.238.5±6.143.2±8.0模型组219.4±11.71)59.3±7.51)198.5±9.21)153.9±8.01)39.2±6.91)26.3±4.11)25.1±5.91)千金片组低剂量205.8±11.01)2)64.2±6.91)2)182.3±8.61)2)139.2±8.31)2)35.4±7.11)2)29.0±3.41)2)30.2±5.71)2)千金片组中剂量187.3±10.81)2)68.7±7.01)2)162.6±9.41)2)131.5±7.61)2)31.7±6.41)2)31.2±3.71)2)34.9±6.21)2)千金片组高剂量172.5±9.61)2)71.1±6.91)2)139.5±8.71)2)122.0±8.91)2)26.2±5.51)2)33.8±5.21)2)38.0±6.51)2)妇炎康组171.9±10.41)2)72.0±5.91)2)138.3±8.11)2)121.4±8.31)2)25.8±5.31)2)34.0±5.41)2)39.2±7.01)2)

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

组别IL-1βIL-10TNF-αIL-8空白组249.3±7.270.6±5.4121.4±7.9149.2±8.0假手术组250.4±8.171.0±6.9120.5±8.0148.7±8.1模型组332.5±15.71)60.2±6.71)167.2±9.91)251.6±9.71)千金片组低剂量313.7±14.01)2)63.2±6.31)2)161.7±8.61)2)232.8±9.41)2)千金片组中剂量287.1±11.61)2)66.9±7.11)2)154.2±7.61)2)215.7±8.91)2)千金片组高剂量264.9±12.01)2)68.5±7.01)2)137.7±8.51)2)176.5±9.31)2)妇炎康组261.8±13.51)2)68.0±5.91)2)135.8±9.01)2)178.3±8.91)2)

3 讨 论

盆腔炎性疾病发病病因尚不清楚，长期的子宫内膜炎性损伤、阴道内炎症细胞的上行性感染以及多次人流导致的宫腔操作等，均为影响盆腔炎发生的独立因素。目前西医对于盆腔炎的治疗仍然以第二代或者第三代抗生素治疗为主，但效果不甚理想，抗生素的静脉滴注往往需要超过1 w才可见明显临床症状缓解，且症状消失后盆腔炎容易复发〔4〕。妇科千金片具有清热除湿，益气化瘀的功效，临床上可用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，特别是对于慢性盆腔炎、子宫内膜炎、慢性宫颈炎导致的妇科症状具有明显的疗效〔5～7〕。IL-1β、TNF-α、IL-8等细胞因子参与到了炎症反应的组织损伤过程，而IL-10具有抑制炎症反应的作用。

盆腔炎对于盆腔结缔组织具有反复损伤性作用，在相关炎症细胞如IL-6以及TNF-α的作用下，结缔组织细胞形态发生改变，而间质成分代偿性增生。HE染色结果，提示在动物模型水平上千金片对于组织损伤的保护性作用。盆腔炎致病以及介导盆腔结缔组织损伤的细胞因子包括IL-1、IL-8、TNF-α以及中性粒胞质刺激因子等，通过促进中性粒细胞以及浆细胞的趋化以及血管损伤作用，进而促进结缔组织炎症性损伤以及修复过程。抑炎细胞因子包括IL-4、IL-10等，主要抑制中性粒细胞的趋化作用而降低组织损伤程度〔8〕。模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8水平显著升高，提示了造模成功；而随着千金片使用剂量的增加，IL-1β、TNF-α、IL-8呈现逐渐下降的趋势，同时保护性细胞炎症因子IL-10逐渐上升。千金片中含有的千斤拔、金樱根、穿心莲，可以“清热除湿，益气化瘀”，调节盆腔局部炎症病变区域的血流以及微环境中的免疫平衡，促进机体自身性保护性炎症因子的释放〔9〕，进而体现出一定的剂量依赖性，提示了在血清学水平上千金片的作用效果。组织学水平也呈现了相似的变化，提示了千金片对于盆腔炎病变组织层面的保护性作用。TNF-α在细胞炎症损伤中通过释放下游炎症损伤性因子而加重组织损伤，千金片在这一过程中的作用可能与抑制TNF-α的激活以及淋巴细胞、巨噬细胞的趋化作用有关，进而降低下游IL-1β、IL-8的释放，但其具体信号通路机制仍然需要进一步探讨。

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3 阮亘杰，郑 波.盆腔炎性疾病常用抗菌药物的特点及使用方法〔J〕.实用妇产科杂志,2013;29(10):728-9.

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〔2016-01-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

内蒙古教育厅课题(No.NJZY16118)；内蒙古医科大学课题(No.2015ykdxkjbw23)

刘 芳(1976-)，女，硕士，副主任医师，主要从事妇产科生殖内分泌研究。

赵 杰(1979-)，男，硕士，助理研究员，主要从事辅助生殖技术研究。

R71

A

1005-9202(2017)01-0032-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.013