pAdKDR/CD/TK双自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用的试验研究

谷 洋，刘志毅，金 虎，刘 明，孙铁梁

(吉林大学第四医院 普通外科，吉林 长春130011)

pAdKDR/CD/TK双自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用的试验研究

谷 洋，刘志毅*，金 虎，刘 明，孙铁梁

(吉林大学第四医院 普通外科，吉林 长春130011)

目的 探讨含KDR启动子的双自杀基因CD/TK对肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法 观察不同前药对HepG2细胞、血管内皮细胞ECV304和LST174细胞的杀伤作用，评估KDR启动子的靶向杀伤作用。观察不同前药对转染不同自杀基因的HepG2细胞的杀伤作用，及旁观者效应。结果 转染腺病毒的HepG2细胞及血管内皮ECV304细胞对前药具有较高的敏感性，而感染腺病毒的LST174细胞对前药不敏感(P<0.05)。当转染细胞混合比例为50%时，应用前药后，转染CD/TK,CD,TK的HepG2细胞生存率分别为11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%(P<0.05)。结论 含KDR启动子的双自杀基因CD/TK对肝癌HepG2细胞具有高度靶向杀伤作用；联合用药对转染双自杀基因的肝癌HepG2细胞具有协调增强杀伤作用。

双自杀基因； KDR启动子；肝癌细胞;基因

(ChinJLabDiagn,2017,21:0132)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，恶性程度高，外科手术治疗效果差。近年来，随着基因治疗肿瘤的深入研究，自杀基因治疗肿瘤成为研究热点，双自杀基因能够产生两种基因的互补增效的作用，我们联合应用TK/GCV,CD/5-FC，研究KDR启动的双自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组腺病毒(吉林大学)，肝癌细胞HepG2(北京细胞研究所)，转染试剂PolyFect (Qiagen 公司) GCV (Roche Pharma 公司) DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清( Gibco 公司),5-FC(Sigma 公司)。

1.2 HepG2细胞的培养

①10 ml PRMI1640细胞生长液，37℃水浴，体积分数70%乙醇浸泡去除污染。将细胞悬液离心(200×g)，5 min，加入5 ml新鲜细胞生长液。新鲜PRMI 1640细胞培养液10 ml，细胞悬液5 ml，37℃，5%CO2；细胞70%时行1∶3传代。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)10 ml清洗细胞，灭活Tyrosine，新鲜PRMI 1640细胞生长液8.5 ml，新鲜PRMI 1640细胞液9 ml，细胞悬液1 ml，37℃下孵育，体积分数5%CO2。细胞70%汇合传代。

1.3 重组腺病毒对HepG2细胞、LST174细胞和血管内皮细胞ECV304的感染率测定

取对数生长期的上述三种细胞培养板，体积分数5%，CO2，37℃，加入不同感染复数的目的腺病毒pAdKDR/CD/TK ，3 d后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞百分比。

1.4 前药不同浓度对细胞的杀伤作用

将HepG2细胞、LST174细胞和ECV304(血管内皮细胞)以接种培养板，用100M0I的重组腺病毒进行转染。将不同浓度的前药GCV和5-FC加入含5%小牛血清培养基，设GCV组、5-FC组和GCV+5-FC组，72 h，MTT法检测细胞生长抑制率。

1.5 pAdEasy-KDR-CD pAdEasy-KDR-TK pAdEasy-KDR-CD/TK重组腺病毒的转染

HepG2细胞培养，体积分数5%CO2，37℃培养，再分别加入10 μl重组腺病毒KDR-CD KDR-TK KDR-CD/TK质量浓度为8 μg/ml，37℃，体积分数5%CO2，荧光显微镜下观察转染效果。

1.6 旁观者效应

取对数生长期的HepG2细胞(转基因和未转基因)，以1×104个细胞/孔接种于96孔培养板中，24 h后不同浓度混合，MTT法检测细胞的存活率。

1.7 药物浓度对腺病毒的HepG2细胞的杀伤效应

1.7.1 将转染和未转染pAdKDR/CD/TK HepG2细胞培养，加入不同浓度的前药5-FC、GCV，设5-FC组、GCV组和GCV+5-FC组，72 h以后，MTT法检测细胞生长抑制率。

1.7.2 将HepG2细胞培养重组腺病毒感染。24 h后，加入不同浓度的5-FC 和GCV，设GCV组、5-FC组和GCV+5-FC组，72 h以后，用MTT法检测细胞生长抑制率。

1.8 统计学方法

实验数据用SPSS11.5软件处理，采取单因素方差分析，组间比较用SNK法，独立样本t检验。

2 结果

2.1 重组腺病毒的酶切PCR鉴定

重组腺病毒质粒经PCR鉴定，目的基因片段均有表达。为证实外源基因导入靶细胞，应用特异基因引物KDR、TK、CD、CD/TK分别进行PCR片段扩增。结果：蛋白电泳分别切出特异性片段，分别为KDR、TK、CD及TK/CD，证实目的基因片段成功导入HepG2细胞(图1)。电镜下可见荧光蛋白GFP的表达，说明重组质粒转染HepG2细胞成功(图2)。

2.2 重组腺病毒对三种细胞(HepG2,ECV304,LST174)感染率的测定

MOI=10时，观察到含荧光的细胞比较少；MOI=100时，含荧光细胞量大于90%；MOI=200，几乎全部为含荧光细胞，说明随腺病毒滴度的变化影响细胞的感染率，细胞的感染率随滴度升高而升高，重组腺病毒对三种细胞的感染效率相似(图3)。通过RT-PCR检测可以发现，除LST174细胞外，均检测到目的基因的表达(图4)。

图1 重组KDR/CD，KDR/TK，KDR/CD/TK质粒酶切鉴定

图2 电镜下可见荧光蛋白GFP的表达

图3 重组腺病毒(AdKDRP-CD/TK)对三种细胞的感染率测定

图4 感染AdKDR-CD/TK细胞的鉴定

2.3 前药对三种细胞(HepG2，LST174，ECV304)的杀伤作用

感染腺病毒的HepG2和ECV304细胞对前药有较高的敏感性；而LS T 174细胞对前药敏感性较差，后者与前二者相比，差异具有统计学意义(P<0.05)(图5)。显示KDR启动子与MCV启动子一样，具有靶向性杀伤作用。

2.4 旁观者效应

从结果看，旁观者效应明显，随转基因细胞所占比例的增加旁观者效应随之增强(图6)。HepG2细胞转染TK和转染CD的旁观者效应相似，转染TK/CD基因的HepG2细胞与之比较，旁观者效应明显增强。当50%为转染细胞时，三者细胞生存率分别为(11.8±1.2)%、(41.3±3.7)%、(43.1±2.3)%，前者与后二者比较(P<0.05)差异均有统计学意义。

2.5 药物的不同浓度对转染腺病毒的HepG2细胞的杀伤敏感性

2.5.1 按照生长的曲线计算出IC50，实验组与对照组GCV分别为50 μg/ml和720 μg/ml，敏感性升高了14.3倍；5-FC的IC50分别为450 μg/ml和14 500 μg/ml，敏感性升高了28倍。而GCV+5-FC IC50分别为GCV15 μg/ml，5-FC75 μg/ml，敏感性是单独用药的3.4和6.8倍，是对照组敏感性的47倍和198倍。提示双自杀基因对前药的协同杀伤作用，对联合用药作用更加显著(图7)。

2.5.2 根据生长曲线计算IC50，GCVIC50和5-FCIC50分别为70 μg/ml和1 000 μg/ml，GCV+5-FCIC50为20/100 μg/ml，联合用药分别是单独用药GCV的3.5倍、5-FC的10倍。提示单用GCV和单用5-FC杀伤作用较强。而GCV+5-FC联合用药则有更强的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.01)，提示联合用药有协同杀伤作用(图8)。

图5 前药对三种细胞的杀伤作用

图6 HepG2细胞转染不同基因的旁观者效应

图7 不同前药浓度对pAdKDR/CD/TKS HepG2细胞对不同前药浓度的杀伤作用

图8 转染KDR-TK/CD基因的HepG2细胞对GCV/5-FC的杀伤敏感性

3 讨论

3.1 KDR启动子的靶向作用

肝癌的生物治疗是近来的研究较多的领域，自杀基因的治疗成为研究热点，但仍有一些问题没有解决，如表达不稳定，转染效率偏低，杀伤效果较差，靶向性不高等。如何高效地将目的基因片段导入靶细胞，而获得比较有效稳定的表达是目前基因治疗的关键。腺病毒载体对来源于上皮细胞具有很高的亲和力，因而大部分实体肿瘤细胞转染率较高[1，2]。研究发现，肿瘤发生转移的原因是因为肿瘤生长具有跟强的血管依赖性，新生血管为肿瘤细胞提供生长所需的氧和养分，促进肿瘤细胞增殖分裂，而使肿瘤细胞通过微循环浸润到周围组织脏器[3，4]。既往对于肝癌的靶向治疗研究较多的是AFP,并且证实AFP驱动子能够增强HSV-TK自杀基因系统对肝癌细胞的特异性杀伤作用[5]。研究表明KDR在许多恶性肿瘤组织内有较高表达，其中包括肝癌组织。肿瘤组织的KDR主要表达在血管内皮细胞，胞膜和(或)胞浆，肿瘤组织中的血管内皮细胞的增殖速度是正常组织的50-100倍，其表达水平随血管内皮细胞更新速度加快及肿瘤恶性程度升高而升高[6，7]，因此抑制AFP表达、抑制肿瘤血管生成可以大大增强抗肿瘤效果。有研究表明[8]构建含有KDR启动子的双自杀基因，既能杀伤肿瘤细胞本身，又能抑制血管生长的双重靶向作用。

PCR酶切方法鉴定显示，TK/CD目的基因在HepG2 和ECV304细胞中有表达，而在LST174细胞无表达。提示KDR启动子特异性选择杀伤作用及度靶向性。

3.2 双自杀基因系统

本实验构建转染pAdKDR-TK/CD、pAdKDR-TK、pAdKDR-CD的HepG2细胞，观察到明显的旁观者效应，混合比例为50%时，细胞生存率分别为11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%，提示双自杀基因TK/CD比单自杀基因CD,TK细胞生存率明显下降，具有更强的旁观者效应，差异具有统计学意义(P<0.05)。分别给予GCV、5-FC、GCV+5-FC，根据生长曲线计算IC50，观察前药的杀伤作用。敏感性是实验组单独用药的3.4倍和6.8倍。是对照组的47倍和198倍。结果显示单独用药时，细胞生存率差异无统计学意义；而转染双自杀基因的HepG2细胞，联合用药分别是单独用药的3.5倍和10倍。前者与后二者相比差异具有统计学意义。数据表明单独应用前药时无论是GCV还是5-FC，转染单自杀基因TK、CD和双自杀基因TK/CD的HepG2细胞的杀伤率相似。而联合应用时，转染双自杀基因的细胞比转染单自杀基因细胞的杀伤率升高明显，差异具有统计学意义。联合用药比单独用药抑制作用明显增强。双自杀基利用二者的作用互补，前药应用剂量减少，耐药性降低，减少前药的毒副作用，放大杀伤效果。加之旁观者效应以及KDR基因的高度选择性，更加增强杀伤的效果。

本实验研究含KDR启动子的双自杀基因对HepG2细胞的杀伤作用，结果提示：KDR启动子具有高度的靶向性，双自杀基因比单自杀基因具有更强的杀伤作用，而且联合用药效果更好。本研究为细胞体外实验，还需进一步的动物实验验证，我们相信随着生物技术的不断发展进步，双自杀基因有可能成为未来一种新的肝癌生物治疗的有效方法。

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The study on killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells

GUYang,LIUZhi-yi,JINHu,etal.

(TheGeneralSurgeryDepartment,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

Objective To investigate the killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells.Methods To observe the killing effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells,ECV304cells and LS174T cells,and evaluated the targeted killing effect of KDR.To observe the killing effect and standby effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells.Results The HepG2 cells and ECV304 cells transfected with recombined adenovirus had high sensitivity to pre-drug.And the LS17T4 cells transfected with recombined adenovirus had no sensitivity to pre-drug(P<0.05).The HepG2 cells which transfected CD/TK,CD and TK genes,the survival rate of are 11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3% respectively(P<0.05) after using the pre-drug.Conclusion KDR promoter driving double suicide gene had high targed killing effect on human hepatic cancer HepG2 cells.There were enhanced killing effect on transfected double suicide genes of human hepatic cancer HepG2 cells when used combined pre-drugs.

Suicide Gene;KDR Promoter;Hepatic Cancer Cell;Gene

1007-4287(2017)01-0132-04

吉林省科技厅自然科学基金面上项目(201115117)

R735.7

A

2016-05-15)

*通讯作者