肿瘤囊泡包装的甲氨蝶呤对肺癌A549细胞放疗增敏作用的体外研究

郑学嵩 王 映 蒙以良 谢有科

·基础研究·

肿瘤囊泡包装的甲氨蝶呤对肺癌A549细胞放疗增敏作用的体外研究

郑学嵩 王 映 蒙以良 谢有科

目的 探讨肿瘤囊泡(tumor cell-derived microparticles,T-MP)包装的甲氨蝶呤(MTX)对非小细胞肺癌A549放疗增敏作用及其机制。方法 MTT法检测T-MP MTX对A549细胞增殖的影响；应用流式细胞术、划痕法、Western blot等方法检测T-MP MTX联合放疗对A549细胞凋亡、迁移能力以及MMP-2、Nanog、Sox-2等蛋白表达变化。结果

甲氨蝶呤；肿瘤囊泡；放疗增敏；细胞周期；同步化；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:001～004)

放疗是肺癌治疗的重要手段，特别适合于无法手术、复发或存在多发转移灶的患者，但至今放疗效果仍不理想。为此，寻找高效的放疗增敏药物成为国内外的研究人员的重要任务。已知处于M期和G2期细胞对放射最为敏感，甲氨蝶呤(MTX)、阿霉素、顺铂等许多化疗药物均可使肿瘤细胞阻断于特定细胞周期而使肿瘤细胞同步化，从而提高放疗敏感性。但这些药物在损伤肿瘤细胞，同时也不同程度地损害正常细胞，其特异性有待提高。肿瘤细胞来源的微颗粒(通俗称为肿瘤囊泡)是肿瘤细胞在发生凋亡或受到不同信号刺激时释放出来的直径为0.1～1.0 μm 的膜状囊泡，在恶性肿瘤细胞中起着传递细胞间生物信息的作用[1-3]。近年来发现肿瘤囊泡可有效地包装多种化疗药物或病毒等，且对肿瘤细胞具有较高的特异性，对正常组织细胞无明显副毒作用，可作为一种高效的天然药物载体[4]。肿瘤囊泡包装的化疗药物能否提高放疗敏感性而减少化疗损伤呢？本研究探讨来源于非小细胞肺癌A549细胞的肿瘤囊泡包装的MTX(tumor cell-derived microparticles methotrexate，T-MP MTX)联合放疗对A549 细胞放射效果的影响及其机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

非小细胞肺癌A549细胞株和支气管上皮细胞株16HBE等购自中科院上海细胞中心。

1.2 药物与试剂

MTX注射液购自山西普德药业股份有限公司，规格：5.0 mg/5.0 mL，使用时以无血清1640 培养液调整浓度至1.0 mmol/L，密封保存于4 ℃冰箱，使用前取适量以细胞培养液调整至所需终浓度。Nanog、Sox-2、MMP-2小鼠抗人单抗购于美国cellsignal公司。细胞周期与凋亡检测试剂盒、四甲基偶氮唑盐(MTT)、内参GAPDH抗体、兔抗小鼠HRP抗体、ECL 发光剂等购于鼎国生物公司。医用直线加速器购自美国瓦里安公司，流式细胞仪(BD FACS ARIA)购于美国BD公司，酶标仪购于美国Biotek公司，垂直电泳仪购自美国GE 公司，硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 T-MP MTX的制备

A549细胞均匀接种于直径为10 cm的培养皿(细胞密度10～20%)，常规培养。细胞生长至70～80%汇合度后，常规更换培养液，加入高剂量MTX，终浓度为10 μg/ml，置于紫外灯下照射1 h，放回恒温培养箱培养。12 h后收获细胞培养液，室温下离心10 min，600 rpm。弃沉淀，将上清液进行离心，15 ℃，2 min，14 000 rpm，弃沉淀，上清液离心，15 ℃，60 min，14 000 rpm，将沉淀以0.5 ml PBS溶解。再次离心，15 ℃，60 min，14 000 rpm。反复洗涤沉淀3次。将沉淀以0.5 ml PBS溶解，取少量样品检测在600 nm波长下OD值，调整T-MP MTX浓度在OD值在1～2之间，15 ℃下保存备用。使用时以细胞培养液按一定比例稀释。

1.4 实验方法

1.4.1 照射方法 采用西门子ONCER直线加速器，剂量率为400 cGy/min(6 MV)X线照射1次。射线由细胞贴壁面垂直经有机玻璃板(厚度1.0 cm)入射，处理后继续常规培养12或24 h。

1.4.2 MTT法检测T-MP MTX对A549细胞增殖影响 取对数生长期的A549细胞和16HBE，分别培养于96孔板，细胞贴壁后加入不同浓度(稀释倍数按1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000)T-MP MTX，继续培养72 h，MTT 法测定2种细胞存活率，酶标仪波长490 nm 处测定吸光度(A)值，重复3 次。计算平均值，根据A 值测定细胞存活率。存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4.3 流式细胞术(FACs)检测T-MP MTX联合放疗对A549细胞凋亡影响 对数生长期的A549细胞培养至30%～40%汇合度时更换含一定浓度的T-MP MTX，继续培养10 h后，细胞分为4组：对照组、2 Gy放疗组、4 Gy 放疗组、6 Gy放疗组，分别进行放射照射处理。对照组不进行放射照射。另设空白组，细胞不予药物及放射照射处理，处理后细胞更换新鲜培养液，继续培养24 h。作为阴性对照。经以上处理后以胰酶消化细胞，制备为单细胞悬液，PBS稀释，调整细胞数为5×105/mL，离心去上清，PBS洗3次，75%预冷乙醇固定，4 ℃过夜。PBS洗3次并重悬，移入流式细胞仪离心管中，加入500 μL碘化丙啶染液，在37 ℃水浴孵育30 min后经流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.4.4 划痕法检测T-MP MTX联合放疗对A549细胞迁移能力的影响 A549细胞培养于6孔板内培养至50%～60%汇合度时，细胞分组及处理同1.4.3，放疗照射后细胞继续培养24 h，各组细胞用10 μL规格的枪头比着直尺，垂直于6孔板背后的横线划痕，细胞经PBS洗涤3次后，加入无血清培养基，在显微镜下拍照并测量细胞边缘相对距离(A值)。放入37度5%CO2培养箱，培养，12 h后观察划痕情况并拍照，并测量划痕边缘相对距离(B值)。迁移距离=(A值-B值)。

1.4.5 Western blot检测T-MP MTX联合放疗对A549细胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表达水平 A549细胞培养于培养皿，细胞分组及处理同1.4.3，收集处理后常规培养24 h后的各组细胞，提取细胞总蛋白，变性后取一定量蛋白样本，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至NC膜上，封闭液封闭1 h，分别加入MMP-2、Nanog、Sox-2一抗，4 ℃孵育过夜。用TBST 洗4 次，每次5 min。加入二抗，37 ℃孵育40 min。在数字显影系统中检测目的蛋白信号。以GAPDH为内参，利用灰度分析法检测蛋白条带的相对蛋白含量。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示并进行单因素组间方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-MP MTX抑制A549细胞增殖

MTT法检测不同稀释浓度的T-MP MTX对A549细胞增殖能力，结果发现，各浓度组的细胞增殖能力均受到不同程度的影响，稀释比例<1∶1000时，细胞存活率明显下降(图1)。相反，T-MP MTX对支气管上皮细胞株16HBE细胞增殖的影响较弱，当较高浓度时(>1∶200)时可轻度地抑制细胞增殖(图1)。

图1 T-MP MTX对A549细胞增殖的影响(MTT法)

2.2 T-MP MTX联合放疗促进A549细胞凋亡

T-MP MTX(稀释比例为1∶1000)处理联合不同剂量放疗处理后，FACS检测显示各组均形成明显的亚二倍体凋亡峰(sub-G1峰)，空白组、对照组、2 Gy组、4 Gy组、6 Gy组的亚二倍体细胞百分数(细胞凋亡率)分别为(0.83±0.14)%、(7.47±0.69)%及(46.12±5.23)%、(54.64±0.71)%及(69.86±1.63)%。与空白组比较，对照组凋亡率明显增高(>9倍)，差异具有统计学意义(P=0.001)，提示T-MP MTX有较强的促凋亡作用。联合放疗的各组细胞凋亡率随着放疗剂量增高而上升。与空白组比较，2 Gy组、4 Gy组、6 Gy组的细胞凋亡率明显增高(>54～84倍)，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明T-MP MTX能与放疗协同作用，明显提高细胞凋亡率。

2.3 T-MP MTX联合放疗抑制A549细胞迁移能力

划痕实验结果表明，以空白组为参考(1.00)，对照组、2 Gy组、4 Gy组及6 Gy组的迁移距离分别为(0.86±0.09)、(0.59±0.05)、(0.27±0.03)和(0.11±0.03)倍;以空白组或对照组比较，2 Gy组、4 Gy组及6 Gy组的迁移距离均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.4 T-MP MTX联合放疗抑制A549细胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表达

Western blot检测结果表明，以空白组表达量为1.00，对照组、2 Gy组、4 Gy组及6 Gy组经处理24 h后MMP-2、Nanog、Sox-2蛋白表达水平均有不同程度下降(表1及图3)。与空白组比较，对照组、2 Gy组、4 Gy组及6 Gy组细胞MMP-2、Nanog、Sox-2蛋白显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，2 Gy组、4 Gy组及6 Gy组细胞以上蛋白也有显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，而且下降幅度与放疗剂量相关。

3 讨论

本研究表明，T-MP MTX可明显抑制肺癌A549细胞增殖，这种效应与T-MP MTX处理浓度存在剂量-效应关系，且在较低的稀释浓度下即有明显的抑制作用。同时T-MP MTX对支气管上皮细胞的增殖无明显抑制作用，即使在较高的浓度下也仅有轻微的抑制作用，说明T-MP MTX具有较高细胞靶向作用，即只对其起源的肿瘤细胞发挥抑制作用，与以往报道一致[4]。本研究选择在半数抑制率浓度附近的稀释浓度进行后续研究(在此浓度下对支气管上皮细胞无抑制作用)。从细胞凋亡结果看，T-MP MTX联合不同剂量。

放疗，其凋亡率随着剂量的增加而提高。A549细胞是一种高度恶性潜能的肺腺癌细胞，具有较强的抗辐射性，对亚致死性放射损伤有较强的修复能力[5]。从细胞凋亡结果看，T-MP MTX联合不同剂量放疗，其凋亡率随着剂量的增加而提高。MTX是抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，阻断肿瘤细胞在S期，从而抑制肿瘤细胞增殖。从凋亡检测结果来看，未进行放疗的对照组经T-MP MTX处理的A549细胞凋亡率较其空白组明显提高(>9倍)，而联合放疗后凋亡率得到更大的提高(>54～84倍)，且随放疗剂量增加而增高。本

指标对照组2Gy组4Gy组6Gy组tPMMP-20.43±0.090.15±0.040.09±0.020.03±0.01-39.610.000Nanog0.54±0.110.16±0.030.06±0.010.02±0.00-88.970.000Sox-20.71±0.080.49±0.060.12±0.030.05±0.01-54.110.000

图3 T-MP MTX联合放疗对MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表达的影响(western blot)

课题组推测，T-MP MTX可能通过特异性靶向作用于A549细胞，提高目标细胞内药物浓度，使细胞周期同步化提高，从而增强肿瘤细胞对X射线的敏感性。

肿瘤的侵袭和转移是抗肿瘤治疗失败的主要原因之一，而放疗剂量不足所致放射损伤是肿瘤侵袭和转移潜能增高的重要因素。已知MMP-2与肿瘤侵袭和转移密切相关。本研究发现，T-MP MTX可抑制A549细胞的迁移能力，下调MMP-2蛋白表达水平。当T-MP MTX联合放疗时这种抑制作用随着放疗剂量增加而加强。这说明T-MP MTX联合放疗对A549细胞的放疗增敏作用全面，不仅抑制肿瘤细胞增殖，还能抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力。最近一项研究也提示口服或静注钠米微粒包装的阿霉素-MTX可通过下调MMP-2的表达，抑制口腔癌的进展，其机制可能与抑制肿瘤侵袭和转移相关的促动基因有关[6]。MTX抑制MMP-2基因表达的分子机制有待进一步研究。

肿瘤干细胞假说认为，肿瘤干细胞是恶性肿瘤复发和转移的根本原因，而针对肿瘤干细胞的治疗是治疗肿瘤的关键。肺癌干细胞的干性标记物包括Nanog、Sox-2、CD133、Oct4、Klf4、β-catenin等，它们在肿瘤干细胞自物更新和增殖方面具有重要的调控作用[7-9]。近年研究表明[4]，肿瘤囊泡不仅对相应的起源细胞有较高亲和性，对肿瘤干细胞的亲和性更高，可作为一种靶向肿瘤干细胞的药物载体工具。本实验结果提示T-MP MTX明显下调肿瘤干细胞相关基因Nanog和Sox-2表达水平，与放疗联合使用可显著加强这种调控效应。这说明T-MP MTX有效影响肺癌干细胞的干性特征，增强放疗效果，但其机制仍有待进一步研究。有研究认为肿瘤囊泡所携带的化疗药物或生物信号可经细胞溶酶体，到达细胞核膜内部，直接作用于核内相应靶点[4,10]。本课题组推测A549来源的T-MP所携带的MTX和细胞凋亡应急产生的信使进入肿瘤干细胞后扰乱肿瘤干细胞的低代谢状态，进入高代谢状态，而高代谢状态细胞对放射射线较为敏感。因此T-MP MTX可能促进低代谢状态的肿瘤干细胞活化，具有较强的放疗增敏作用，更有效地减少肿瘤复发。

此外，来源于凋亡肿瘤细胞的肿瘤囊泡被证实有一定的诱导机体肿瘤免疫的作用，其内含的DNA片段及肿瘤抗原经树突状细胞吞噬后活化树突状细胞并呈递到细胞表面，从而激活特异性细胞免疫[11-13]。而本研究证实，T-MP MTX联合放疗特异地抑制A549细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡，提高放疗敏感性，其机制可能与T-MP MTX诱导细胞周期同步化，以及干扰肿瘤干细胞低代谢状态有关。因此，T-MP MTX抗肿瘤机制是多通路多靶点的，与联合放疗可能具有较高的抗肿瘤效应，值得进一步研究及临床推广。

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(编辑：甘 艳)

Radiosensitization Effect of Methotrexate Packaged by Tumor Derived Microparticles on Lung Cancer A549 Cells in Vitro

ZHENGXuesong,WANGYing,MENGYiliang,etal.

BaisePeople’sHospital,Baise,533000

Objective To explore the radiosensitization effect and mechanism of methotrexate packaged by tumor derived microparticles(T-MP MTX)on non-small cell lung cancer A549 cells.Methods The effect of T-MP MTX on A549 cells proliferation was assayed by MTT method;Cell apoptosis and migration capability of cells were detected by fluorescence activated cell sorting(FACS)and cell detachment test;The expression of MMP-2,Nanog and Sox-2 was measured by Western blot.Results MTT assay showed that T-MP MTX dose-dependently suppressed the proliferation of A549 cells,and played a role of antitumor in low concentration.The effect of T-MP MTX on the proliferation of bronchial epithelial cells line 16HBE was weak,but it slightly suppressed cell proliferation in high concentration.The result of FACS implied that T-MP MTX combined with radiation enhanced the apoptosis on A549 cells，in which the effect was relied on radiation dosage(P<0.05).T-MP MTX combined with radiation efficiently eliminated the migration ability of A549 cells in cell detachment test,and its effect was similar to the change of cell apoptosis(P<0.05);The expression of MMP-2,Nanog and Sox-2 notably decreased when A549 cells was treated with T-MP MTX combined with radiation,during which the effect was negative to radiation dosage(P<0.05).Conclusion T-MP MTX combined with radiation specially enhanced cell apoptosis,suppressed cell migration,and reinforced sensitization of radiation in A549 cells through increasing of cell cycle synchronization and obstructing low metabolic state of cancer stem cells by T-MP MTX.

Methotrexate;Radiosensitization;Tumor derived microparticles;Cell cycle;Synchronization;Apoptosis

国家自然科学基金资助项目(编号：81560476)；八桂学者建设工程专项经费资助

533000 广西百色市人民医院(郑学嵩，蒙以良)；533000 右江民族医学院基础学院(王 映)；530011 广西中医药大学附属瑞康医院(谢有科)

谢有科

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.001

R734.2

A

1001-5930(2017)01-0001-04

2016-01-20

2016-06-12)

MTT法检测提示T-MP MTX浓度依赖性地抑制A549细胞增殖，并且在较低浓度下即发挥抑癌作用。T-MP MTX对支气管上皮细胞株16HBE细胞增殖的影响较弱，在较高浓度可轻度地抑制细胞增殖。细胞凋亡检测发现T-MP MTX联合放疗扩大A549细胞凋亡，其作用与放疗剂量有关(P<0.05)。划痕实验提示T-MP MTX联合放疗有效抑制A549细胞迁移能力，其作用与放疗剂量有关(P<0.05)；Western blot检测表明T-MP MTX联合放疗显著下调A549细胞MMP-2、Nanog和Sox-2蛋白表达水平，此作用与放疗剂量有关(P<0.05)。结论 T-MP MTX联合放疗特异地抑制A549细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡，提高放疗敏感性，其机制可能与T-MP MTX诱导细胞周期同步化，以及干扰肿瘤干细胞低代谢状态有关。