辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞黏附分子及NF-κB通路表达的影响

罗 丹，郝 刚，林思思，夏宇轩，陈彤丹

(1.浙江省人民医院药学部，杭州 310014；2.江苏省苏州市食品药品检验所 215104)

辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞黏附分子及NF-κB通路表达的影响

罗 丹1，郝 刚2，林思思1，夏宇轩1，陈彤丹1

(1.浙江省人民医院药学部，杭州 310014；2.江苏省苏州市食品药品检验所 215104)

目的 探讨辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮(HUVEC)损伤的保护作用及机制。方法 体外培养原代HUVEC，将细胞分为3组：空白组、LPS组及辛伐他汀组。空白组无任何处理，LPS组用LPS刺激，辛伐他汀组先用辛伐他汀(处理浓度也分别为5、25、50 μmol/L)处理24 h，然后再用LPS处理。用荧光定量PCR的方法测定血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子(ICAM-1)和E选择素(E-Selectin)的mRNA表达，用免疫印迹的方法测定VCAM-1及磷酸化p-105(p-p105)的蛋白表达。结果 LPS对HUVEC有明显的损伤作用，导致VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin表达显著上升。辛伐他汀可以明显减弱LPS对HUVEC的损伤作用，且效果呈剂量相关性。结论 辛伐他汀通过NF-κB途径减弱LPS对HUVEC的损伤，起到保护内皮细胞的作用。

动脉硬化；内皮，血管；血管黏附分子；人脐静脉内皮细胞；辛伐他汀；NF-κB通路

动脉粥样硬化(arteriosclerosis，AS)是冠心病、中风等严重威胁人类健康疾病的共同病理基础，已经成为我国主要死亡原因之一。目前普遍认为，AS是多种因素导致的复杂慢性炎症过程，起始环节为动脉内皮的损伤、黏附分子的高表达，然后是白细胞与内皮黏附、脂质沉积、板块形成等过程[1]。他汀类药物在降低血脂、预防AS等方面的作用已被大量循证医学证据证实。近年有研究发现，他汀类药物还可以保护内皮细胞、降低黏附分子的表达，这些研究发现阐明了他汀类药物预防AS的其他途径。本实验研究旨在探讨辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用，以及核转录因子kappa B(NF-κB)通路是否参与了该保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 原代HUVEC购自Allcell公司；培养基(ECM，包含牛血清、双抗、原代HUVEC生长所需的细胞因子)购自Sciencell公司。实验用脂多糖(LPS)购自Sigma公司；辛伐他汀购自Merck公司。总RNA提取试剂盒UNIQ-10购自生工公司；mRNA逆转录试剂盒(FSQ101)购自TOYOBO公司；qPCR检测试剂盒SYBR购自TAKARA公司；qPCR引物由生工合成。蛋白提取RIPA+PIC及蛋白质定量试剂盒(BCA)试剂盒购自Thermo公司；血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体购自Abcam公司；磷酸化p-105(p-p105)抗体购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培养、分组及干预 采用Thermo培养箱，于37 ℃、5%CO2条件下培养HUVEC，实验时采用第2～5代细胞。细胞处理时分为3组：空白组、LPS组及辛伐他汀组。空白组无任何处理，LPS组用0.2 μg/mL的LPS刺激6 h(用于mRNA检测)或24 h(用于蛋白检测)；辛伐他汀组先用辛伐他汀处理24 h(处理浓度分别为5、25、50 μmol/L)，然后再用LPS处理6 h或24 h。HUVEC的损伤反应采用黏附分子的表达进行判断，在mRNA层面检测VCAM-1、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和E选择素(E-Selectin)，在蛋白层面检测VCAM-1，进一步确认该分子的表达。NF-κB通路的活化采用p105磷酸化水平进行判断，LPS刺激HUVEC 30 min后即提取细胞蛋白，用以检测p-p105水平。

1.2.2 荧光定量PCR 采用生工公司的试剂盒提取总RNA，逆转录后用SYBR进行荧光定量检测。检测指标为内皮细胞损伤后表达的黏附分子，包括VCAM-1、ICAM-1和E-Selectin，内参为GAPDH。检测仪器为ABI 7500 Real-Time仪，反应条件为：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s)×40个循环。引物由生工合成，序列为:VCAM-1 F 5′-GCT GCT CAG ATT GGA GAC TCA-3′，R 5′-CGC TCA GAG GGC TGT CTA TC-3′；ICAM-1 F 5′-TCT GTG TCC CCC TCA AAA GTC-3′，R 5′-GGG GTC TCT ATG CCC AAC AA-3′；E-selectin F 5′-AAT CCA GCC AAT GGG TTC G-3′，R 5′-GCT CCC ATT AGT TCA AAT CCT TCT-3′；GAPDH F 5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′，R 5′-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3′。

1.2.3 蛋白印迹分析 采用RIPA+PIC提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。检测指标为VCAM-1蛋白和NF-κB通路的p-p105蛋白。上样时，每孔加30 μg蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，转至硝酸纤维膜上，BSA封闭，按照1∶1 000比例稀释后加入VCAM-1抗体，4 ℃孵育过夜，次日TBST洗涤3次，每次10 min，然后按照1∶5 000稀释加入二抗，室温孵育1.5 h，再以TBST洗涤3次，每次10 min。曝光后用ImageJ分析条带强度。

2 结 果

2.1LPS对HUVEC的损伤作用 实验发现LPS组中VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin的mRNA和VCAM-1蛋白的表达水平均显著上升，与空白组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见图1、2。

2.2 辛伐他汀对HUVEC的保护作用 辛伐他丁组中的3个亚组的黏附分子的mRNA和VCAM-1蛋白的表达水平均较LPS组降低，且差异有统计学意义(P<0.05)(图1、2)。同时3个不同辛伐他丁浓度的亚组间比较也差异有统计学意义(P<0.05)。辛伐他汀可抑制VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin的mRNA和VCAM-1蛋白的表达，且抑制效果呈剂量相关性。

2.3 辛伐他汀对HUVEC保护作用的可能机制p-p105水平的蛋白印迹分析发现LPS组表达水平较空白组上升，而辛伐他丁组的3个亚组均较LPS组降低，且3个亚组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。LPS损伤HUVEC的信号通路可能为NF-κB途径，辛伐他汀可抑制NF-κB通路保护HUVEC，且抑制效果呈剂量相关性。

图1 各组黏附分子的mRNA水平表达

图2 各组VCAM-1蛋白水平表达

图3 各组HUVEC的p-p105表达

3 讨 论

AS是一种慢性进行性疾病，其形成涉及遗传、血脂紊乱、高血压、糖尿病、抽烟、细菌内毒素、免疫紊乱等多种危险因素。这些因素共同作用导致血管内皮损伤，单核细胞黏附结合于内皮细胞、进入内膜下，转化形成巨噬细胞，进而吞噬脂质，形成泡沫细胞，最终推动AS斑块的进展。因此内皮细胞损伤作为AS的始动环节，长期以来受到研究者的重视。

他汀类药物是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，具有显著降低胆固醇的作用，其对冠心病的治疗已得到国际指南的广泛认可与推荐[2]。近些年研究发现他汀类药物还可以保护内皮细胞，但这些研究大多以观察现象为主[3-6]，证实阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等药物可以减少黏附分子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、低密度脂蛋白受体1(LOX-1)等表达，而并未对作用机制做深入探讨。内皮细胞损伤有多种信号途径介导，包括受体酪氨酸激酶途径、NF-κB途径、丝裂原活化蛋白激酶途径、活性氧途径等[1]，其中NF-κB途径最常见、也最被广泛研究[7]。LPS、oxLDL、TNF-α等均可以激活内皮细胞的NF-κB通路[8-9]。因此，阻断NF-κB通路成为治疗AS的新途径[10]。本研究首先证实LPS能够通过NF-κB途径损伤HUVEC，导致后者高表达黏附分子，然后发现辛伐他汀能减弱LPS对HUVEC的损伤，并且证实该机制是通过NF-κB途径完成的。

他汀类药物对NF-κB通路的作用，在其他细胞中已有研究者进行了报道[11]，也有学者在小鼠缺血/复灌模型中证实他汀类药物可以通过NF-κB途径改善心脏功能[12]。本研究提示，他汀类药物也可以在内皮细胞中影响NF-κB通路，该发现有利于重新认识他汀在冠心病治疗中的作用。

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罗丹(1986-)，药剂师，硕士，主要从事临床药学方面研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.032

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